过氧化物酶体增殖物激活受体δ激动剂GW0742对同型半胱氨酸诱导人内皮细胞p47phox的影响及机制

发布时间：2017-12-13 19:10

  本文关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体δ激动剂GW0742对同型半胱氨酸诱导人内皮细胞p47phox的影响及机制

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【摘要】：目的:动脉硬化是是临床上的常见病与多发病,是一种会造成人们患上冠心病、脑血管病等,从而严重危害身体健康和生命的疾病。同型半胱氨酸可以通过不同的信号传导途径激活NADPH氧化酶,产生大量的ROS,导致一系列的病理和生理改变,是动脉粥样硬化的发生的一个重要因素。PPARδ的激活,可能通过其抗氧化和抗炎的作用减少ROS的产生,防止血管内皮组织功能紊乱的发生,从而限制动脉粥样硬化的发展,将来它可能会成为预防和治疗动脉硬化的新靶点。在本实验中,我们应用HCY干预EA.hy926细胞诱导氧化应激发生,并应用GW0742干预细胞作为对照,观察p47phox m RNA,P-p38MAPK、P-p47phox和PPARδ蛋白水平的改变,探讨PPARδ抑制氧化应激的机制。方法:1.EA.hy926细胞传代培养。2.细胞无血清培养24h后,使用同型半胱氨酸(50μM)对细胞进行刺激30min。提取总RNA,RT-PCR法测定p47phox m RNA的表达量。3.细胞无血清培养24h后,使用同型半胱氨酸(50μM)在不同的时间(0-40min)对细胞进行刺激。提取总蛋白,Western blot测定p47phox的磷酸化水平。4.细胞无血清培养24h后,A组实验使用同型半胱氨酸(50μM)在不同的时间(0-60min)对细胞进行刺激;B组实验使用GW0742(1μM)预处理细胞30min,再使用同型半胱氨酸(50μM)对细胞刺30min。用氧化还原敏感的荧光染料DCFH-DA干预细胞,然后用荧光显微镜测定细胞内ROS的水平。\5.细胞无血清培养24h后,使用同型半胱氨酸(50μM)在不同的时间(0-40min)对细胞进行刺激。提取总蛋白,Western blot测定PPARδ的蛋白水平。6.细胞无血清培养24h后,使用或不使用GW0742(1μM)或GSK(1μM)预处理细胞30min,再使用或不使用HCY(50μM)刺激细胞30min。提取总蛋白,Western blot测定PPARδ的蛋白水平。7.细胞无血清培养24h后,细胞使用GW0742(1μM)预处理,然后使用HCY(50μM)刺激30min,或单独使用两种药物干预30min。提取总蛋白,Western blot测定p38MAPK的磷酸化水平。8.细胞无血清培养24h后,细胞使用GW0742(1μM)或SB203580(20μM)预处理细胞30min,然后使用HCY(50μM)刺激细胞30min。提取总蛋白,Western blot测定p47phox的磷酸化水平。结果:1.EA.hy926是人类内皮细胞杂交瘤细胞系,具有与原始内皮细胞相同的形态学分布生物学活性。2.同型半胱氨酸可以明显增加p47phox m RNA在EA.hy926的表达。3.同型半胱氨酸呈时间依赖性增加p47phox的磷酸化,各组分别是空白对照组的1.25、1.45、1.55、1.2倍,当刺激时间为30min时达最高峰。4.同型半胱氨酸呈时间依赖性地增加活性氧的产生,各组分别是空白对照组的1.1、1.5、2.1、1.8倍,当HCY刺激时间为30min时,活性氧的产生达到最高峰;PPARδ激活明显抑制活性氧的产生。5.同型半胱氨酸呈时间依赖性增加PPARδ的表达,各组分别是空白对照组的1.06、1.1、1.25、1.02倍,当刺激时间为30min时达最高峰。6.单独使用同型半胱氨酸和GW0742不同程度地增加PPARδ表达,而在同型半胱氨酸诱导的氧化应激中,GW0742能显著地增加PPARδ的表达,各组分别是空白对照组的1.25、1.6、2、1.3、1.1倍。7.GW0742能够抑制同型半胱氨酸诱导的p38MAPK的磷酸化,各组分别是空白对照组的2、1.5、1.05倍。8.同型半胱氨酸通过p38MAPK信号传导通路增加p47phox的磷酸化;GW0742能减少p47phox的磷酸化,各组分别是空白对照组的1.4、1.1、0.9倍。结论:HCY通过p38MAPK通路引起p47phox的磷酸化增加ROS,GW0742在HCY诱导的氧化应激中显著增加PPARδ,进而减少p38MAPK和p47phox的磷酸化,降低ROS的产生。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5

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