体外模拟内皮功能异常及冠状动脉痉挛微环境下caveolin-1与NO及ET-1相关性的研究

发布时间：2017-12-13 22:07

  本文关键词：体外模拟内皮功能异常及冠状动脉痉挛微环境下caveolin-1与NO及ET-1相关性的研究

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【摘要】：目的通过体外细胞实验研究致内皮损伤物质脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及致冠状动脉痉挛物质乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）序贯作用的微环境下，人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）表达caveolin-1与分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)及内皮素-1（endothelin-1，ET-1）的相关性，初步探索caveolin-1是否在体外模拟内皮功能异常导致冠状动脉痉挛发病过程中发挥病理生理作用。 方法 1.人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离、培养及鉴定。取无HIV、HBV感染，无妊娠期高血压的健康孕妇剖腹产脐带，在无菌环境中用0.1%I型胶原酶于37℃消化12min得到HUVEC，，接种于M199完全培养基(含20%胎牛血清、20ng/ml VEGF165、25μg/ml肝素、1%青链霉素双抗)，37°C含5%CO2的温箱培养。倒置显微镜观察内皮细胞生长情况，免疫荧光法鉴定内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原。取3-5代的HUVEC进行实验。实验共分五组：A.空白对照组（依据具体实验只加一定量的培养基与相应试剂）；B.阴性对照组HUVEC；C.实验组①HUVEC+LPS；D.实验组②HUVEC+Ach；E.实验组③HUVEC+LPS+Ach。 2.脂多糖（LPS）构建内皮功能损伤模型：①CCK8（cell counting kit-8）法观察LPS对HUVEC活性的影响，采用该法分别摸索LPS干预浓度梯度及时间梯度。②Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡。③WST-1（一种高度水溶性四唑盐）法测定检测细胞上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dimutase，SOD)的抑制率。 3.根据2的实验结果，LPS以50μg/ml24h及100μg/ml24h为干预条件处理HUVEC构建内皮损伤模型，以此细胞模型为基础用10μmol/L乙酰胆碱（Ach）模拟冠脉痉挛微环境：①采用激光共聚焦技术，以荧光指示剂Fluo-3为探针，观察Ach对内皮细胞[Ca2+]i水平的影响，用以评价冠脉痉挛模型是否构建成功。②硝酸还原酶法测定细胞上清NO含量。③酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测细胞上清液中ET-1含量。 ④Western-blot检测细胞膜caveolin-1蛋白表达情况。结果 1.倒置荧光显微镜和免疫荧光结果显示，I型胶原酶消化法可成功分离HUVEC，培养的HUVEC在3-5代细胞形态最为典型，增殖最快，活力最好，6代开始细胞形态趋于不规则，增殖减慢，活力逐渐下降。 2.实验组①与阴性对照组相比：1）CCK8结果表明，LPS较为合适的干预条件为50μg/ml24h(P 0.01)及100μg/ml24h (P 0.001)。2）Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡结果表明，与阴性对照组相比，LPS为50μg/ml24h(P0.05)及100μg/ml24h(P 0.001)干预HUVEC后凋亡率均明显增加，差异有统计学意义。3)WST-1法检测SOD抑制率结果表明，与阴性对照组相比，LPS为50μg/ml24h(P 0.05)及100μg/ml24h(P 0.05)干预HUVEC后检测细胞上清SOD抑制率明显降低，差异有统计学意义。 3.根据2，LPS以50μg/ml24h及100μg/ml24h为干预条件处理HUVEC构建内皮损伤模型，此基础上根据文献资料选取10μmol/L浓度的Ach干预细胞： 1）与实验组②相比，实验组③LPS为50μg/ml24h组[Ca2+]i峰值平均水平降低不明显（P0.05），差异无统计学意义；实验组③LPS为100μg/ml24h组[Ca2+]i峰值平均水平降低明显（P 0.05），差异有统计学意义。2）硝酸还原酶法检测细胞培养上清NO分泌量，与实验组②相比，实验组③LPS为50μg/ml24h(P 0.05)及100μg/ml24h(P 0.05)细胞上清NO分泌量均明显减少，差异有统计学意义。3）ELISA法检测细胞培养上清ET-1分泌量，与实验组②相比，实验组③LPS为50μg/ml24h(P 0.05)及100μg/ml24h(P0.05)细胞上清ET-1分泌量均明显增加,差异有统计学意义。4）Westernblot检测HUVEC胞膜表面caveolin-1表达情况，与实验组②相比，实验组 ③LPS为50μg/ml24h组胞膜表面caveolin-1表达升高不明显（P0.05），差异无统计学意义；实验组③LPS为100μg/ml24h组胞膜表面caveolin-1表达升高明显(P 0.05)，差异有统计学意义。 结论 1.采用I型胶原酶消化法可成功分离HUVEC，并进行体外培养及传代，3-5代细胞最适合用于实验研究。 2. LPS以50μg/ml24h及100μg/ml24h为干预条件处理HUVEC可导致细胞活性降低、凋亡率升高及SOD抑制率降低，可成功构建内皮损伤模型。 3.在内皮损伤的基础上以10μmol/L浓度的Ach处理HUVEC，[Ca2+]i峰值平均水平降低，可体外模拟冠脉痉挛微环境；同时可见，caveolin-1蛋白表达增多，NO分泌减少，ET-1分泌增多，caveolin-1蛋白表达与NO分泌呈负相关，与ET-1分泌呈正相关。
【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.4

【参考文献】

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本文编号：1286742