miR-146a对血小板免疫炎症的影响及其机制的研究

发布时间：2017-12-22 09:01

  本文关键词：miR-146a对血小板免疫炎症的影响及其机制的研究　出处：《南昌大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： miR-146a 血小板 免疫炎症 TLR4/NF-ΚB信号通路

【摘要】：目的:探讨miR-146a对巨核细胞裂解产生的血小板免疫炎症功能的影响及miR-146a对血小板免疫炎症功能调控作用的机制。方法:(1)通过体外培养双分化潜能的K562细胞,采用佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导其向巨核细胞系分化,并最终可产生血小板;(2)通过向分化的巨核细胞内分别导入miR-146a模拟物和阻遏物,转染设置5个组,正常对照组:佛波酯诱导K562细胞产生血小板组;miR-146a mimic组:miR-146a模拟物导入佛波酯诱导K562细胞产生血小板组;miR-146a inhibitor组:miR-146a抑制物导入佛波酯诱导K562细胞产生血小板组;mimic-NC组:将mi R-146a模拟物阴性对照导入佛波酯诱导K562细胞产生血小板组;inhibitor-NC组:将miR-146a抑制物阴性对照导入佛波酯诱导K562细胞产生血小板组。(3)用q-RT-PCR检测各组细胞中miR-146a表达水平的变化;用ELISA检测血小板免疫炎症分子IL-6、TNF-α分子水平;用RT-PCR检测各组细胞中血小板免疫炎症分子——NF-ΚB mRNA表达水平;用Western Blotting检测各组细胞中血小板免疫炎症分子——TLR4、NF-ΚB蛋白表达水平。(4)利用三种常用的靶基因预测软件(TargetScan;PicTar;miRanda)预测miR-146a可能作用的靶基因,结合miR-146a在调控血小板免疫炎症过程中的作用,在预测结果交集中筛选出IRAK1基因为潜在的靶基因;(5)通过荧光素酶报告基因法验证IRAK1是否含有miR-146a的靶位点;(6)通过检测过表达或抑制表达miR-146a后细胞中靶基因IRAK1 mRNA水平及蛋白水平的变化,从而确定miR-146a对靶基因IRAK1的影响。结果:(1)佛波酯成功诱导k562细胞分化为产血小板巨核细胞;(2)与miR-146a mimic阴性对照组相比,miR—146a mimic组miR—146a的表达显著升高(约77.5倍),细胞上清液中IL-6、TNF-a显著降低(p0.05);TLR4蛋白表达显著升高(P0.05),NF-KB mRNA及NF-KB蛋白明显降低(P0.05);与miR-146ainhibitor阴性对照组相比,miR-146a inhibitor组miR-146a表达下降(约7.5倍),细胞上清液中IL-6、TNF-a显著升高(p0.05);TLR4蛋白表达显著降低(P0.05),NF-KB mRNA及NF-KB蛋白明显升高(P0.05);(3)生物信息软件预测出IRAK1为hsa-mir-146a作用的靶基因;双荧光素酶报告基因实验结果显示,Pmir-Report-WT-IRAK1和miR-146a mimic共转染组的荧光素酶报告基因活性明显受到抑制,而Pmir-Report-MUT-IRAK1和miR-146a mimic共转染组、Pmir-Report-WT-IRAK1和mimic-NC共转染组、Pmir-Report-MUT-IRAK1和mimic-NC共转染组的荧光素酶报告基因活性均无明显变化;miR-146a过表达可抑制IRAK1蛋白表达水平,而对IRAK1 mRNA水平无影响。结论:(1)miR-146a调控血小板免疫炎症分子IL-6、TNF-α的表达;(2)证实miR-146a可能是通过其靶基因IL-1受体相关激酶1(IRAK1)作用于TLR4/NF-ΚB信号通路,从而调控血小板免疫炎症。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54;R743

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本文编号：1319171