sDR5-Fc抑制炎症反应改善大鼠心肌缺血—再灌注损伤

发布时间：2018-01-25 06:34

本文关键词： sDR5-Fc MI/R 炎性损伤心功能心肌纤维化　出处：《河南大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是对人类健康造成严重危害的心血管急危重症。临床治疗AMI主要是梗死后在最短的时间内进行溶栓(尿激酶、链激酶等)和直接经皮冠状动脉腔内成形术(PCA),以减小梗死范围,挽救因氧气和能量供应不足而濒临死亡的心肌细胞。而在AMI的治疗和自然转归过程中,常伴发心肌缺血-再灌注损伤(MI/RI),引起更大范围的心肌细胞死亡,主要是再灌注加速了严重损伤细胞的死亡过程,并伴随了以炎症细胞浸润和炎症因子产生为特征的强烈的炎症反应,最终可能导致心肌梗塞、纤维化、心肌肥厚和心力衰竭。近年来研究发现,炎症因子表达量的高低和缺血后心脏功能的损害与细胞坏死数量的多少密切相关,并在其中起了非常重要的作用。众多基础实验结果证实,通过药物拮抗炎症反应的发生发展可以有效下调炎症反应,从而改善缺血-再灌注损伤(I/RI)。在大鼠心肌缺血-再灌注(MI/R)模型中,Fucoidan可以通过抑制炎症通路的活化,同时减少炎症介质表达及促炎细胞的浸润,减轻缺血-再灌注损伤来保护大鼠肝脏;Dongdong Sun等的研究也证明,Luteolin可以抑制MPO及炎症因子包括IL-6,IL-1α及TNF-α的表达,这些都有益于减少MI/R后心肌梗死面积,提高心功能。课题组经过十余年的探索,发现TRAIL/DR5与心肌梗死密切相关,前期利用酵母来源的人sDR5阻断TRAIL/DR5通路可显著减少模型大鼠的AMI心肌梗死面积,减轻心肌梗死程度,相关成果已获批国家发明专利(专利号:ZL 201210442685.6)。此外,TRAIL可与其受体结合而介导炎症反应。为了延长体内半衰期及增加疗效,利于蛋白生产及纯化,更好的向药物开发转化,我们进一步将sDR5与人IgG1的Fc片段进行融合,形成sDR5-Fc抗体融合蛋白,并构建sDR5-Fc抗体融合蛋白高表达稳转细胞株,在哺乳动物细胞CHO中进行大规模表达、纯化,得到产量高、活性好的sDR5-Fc抗体融合蛋白。并推测,sDR5-Fc蛋白可通过阻断TRAIL,并抑制炎症反应,改善心肌缺血-再灌注引起的炎性损伤,限制心肌梗死面积的扩大从而保护心肌细胞。我们在已有报道和实验室前期研究基础上,通过建立心肌缺血-再灌注大鼠模型,检测sDR5-Fc对心肌梗死面积的影响以及炎症因子表达、炎症细胞浸润和心肌纤维化情况,探讨炎症反应在心肌缺血-再灌注大鼠模型中发挥的效应及sdr5-fc对其的作用,综合评价人sdr5-fc蛋白作为新型心肌梗死治疗药物的可行性。为进一步揭示心肌缺血-再灌注损伤机制提供实验基础,为有效防治mi/r开辟新思路。目的:建立大鼠心肌缺血-再灌注模型,从大鼠心脏组织的形态结构、蛋白水平、rna水平及组织学等方面探讨sdr5-fc对大鼠心肌缺血-再灌注(mi/r)的保护作用及相关炎症机制。方法:1、建模及取材:我们选择8周龄的wistar雄性大鼠,将实验鼠按照随机数字表法分为三组,通过结扎左冠状动脉前降支使其心肌缺血,并在1h后松开结扎线行再灌注处理,建立大鼠急性心肌缺血-再灌注模型,并对各组大鼠给予相应处理:药物组(sdr5-fc,16mg/kg)、磷酸盐缓冲液组(phosphatebuffersolution,pbs和假手术(sham)组(只开胸不结扎,其他处理同pbs组)。同时在再灌注后3h、24h及2w时剥离心脏获取结扎线下方的心脏组织。2、模型及用药效果鉴定:通过伊文氏蓝-2,3,5-氯化三苯基四氮唑(evansblue-2,3,5-triphenyltetrzoliumchloride,evansblue-ttc)双色染色法检测心肌梗死面积;利用苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin,he)检测组织切片中心肌组织的形态结构;3、模型中炎症因子表达情况检测:通过实时定量pcr(rt-pcr)及免疫印迹法(westernblot,wb)测定心肌组织中tnf-α、il-1β、il-6等炎症因子的表达;用quantityone软件对wb结果进行半定量分析。4、模型中炎症细胞浸润情况检测:通过免疫组织化学法(immunohistocheistry,ihc)检测心肌中巨噬细胞、t淋巴细胞等炎症细胞的浸润情况;5、心功能检测:通过超声心动图检测心肌缺血1小时-再灌注2周(i1h-r2w)的大鼠心功能;6、心肌纤维化检测:通过masson三色染色法检测心肌缺血1小时-再灌注2周的心肌纤维化情况。结果:1、成功建立急性mi/r大鼠模型。2、he染色检测大鼠心肌组织形态学变化可见pbs组梗死部位出现心肌细胞排列紊乱,有的细胞出现核破碎,心肌横纹消失;与pbs组相比较,i/r+sdr5-fc组梗死区域的心肌细胞呈梭形排列,较为整齐有序,心肌横纹明显。3、RT-PCR检测心肌组织中炎症因子mRNA表达水平,结果显示,PBS组的TNF-α、IL-1β、IL-6表达较Sham组上调;与PBS组相比,注射sDR5-Fc组大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6表达下调。4、Western blotting检测心肌组织中炎症因子表达,结果显示,PBS组的TNF-α、IL-1β、IL-6表达较Sham组上调;与PBS组相比,注射sDR5-Fc组大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6表达下调;与RT-PCR结果一致。5、免疫组化检测发现,PBS组巨噬细胞、T淋巴细胞浸润比Sham组增多;而sDR5-Fc注射处理组的浸润量减少。6、心肌缺血-再灌注2周,与Sham组相比,PBS组超声心动图显示有明显的心肌运动平缓,心电图显示有ST段抬高;而sDR5-Fc组ST段恢复平稳,心功能较PBS组得到明显改善。7、心肌缺血-再灌注2周,心肌纤维化,与Sham组相比,PBS组与sDR5-Fc组有明显的心肌纤维化;用药sDR5-Fc后心肌纤维化面积比PBS组明显减少。结论:sDR5-Fc可以通过抑制心肌组织中炎症因子分泌及炎症细胞浸润,减少大鼠心肌纤维化面积,从而减少缺血-再灌注后心肌梗死面积、改善大鼠心功能,发挥保护心肌细胞作用。
[Abstract]:Background : Acute myocardial infarction ( AMI ) is a serious risk to human health . The clinical treatment of AMI is mainly caused by myocardial infarction , fibrosis , myocardial hypertrophy and heart failure . Objective : To study the effects of sDR5 - fc on myocardial ischemia - reperfusion ( mi / r ) and to construct sDR5 - Fc antibody fusion protein . The expression of TNF - 伪 , IL - 1尾 , IL - 6 in myocardial tissue was detected by means of real - time quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and Western blotting . The results showed that the expression of TNF - 伪 , IL - 1尾 , IL - 6 in myocardial tissue was regulated by means of quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and Western blotting .

【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.22

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