胸主动脉夹层的CircRNA表达谱及可能调控机制分析

发布时间：2018-02-01 23:30

本文关键词： 胸主动脉夹层非编码RNA 环状RNA 芯片生物信息学　出处：《南方医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的:胸主动脉夹层(thoracic aortic dissection,TAD)是致命的主动脉疾病之一,尽管随着诊断与治疗技术的提高,高血压、动脉粥样硬化、吸烟等危险因素的严格控制,TAD的发病率和死亡率仍然较高。面对如此临床困境,仍然没有预防TAD形成与进展的药物治疗方法,主要是我们对TAD的发病分子机制不清楚,既往的基因研究关注有遗传背景TAD的致病基因即编码平滑肌细胞及细胞外基质基因的变异,在一定程度上解释了 TAD的发病机制,而关于散发型TAD研究较少,虽然从蛋白组织学及基因组学发现了散发型TAD差异表达基因,但对差异表达基因的上游调控研究较少。近来,非编码RNA特别环状RNA(CircularRNAs,CircRNAs)是新发现的基因表达的调控因子。本研究旨在从CircRNAs的角度探讨急性A型TAD的可能发病机制。材料和方法:1.收集2015年在广州军区广州总医院和中山市人民医院心外科行手术治疗的急性A型TAD血管标本及心脏移植供体心脏的正常升主动脉标本各6例。用HE染色和免疫组化研究升主动脉血管的病理特点。2.应用NanoDropND-1000检测纳入芯片实验的6例标本(各3例)中RNA的质量。对符合条件6例标本进行Arraystar Human CircRNA芯片检测,利用Agilent Feature Extraction软件提取微阵列的图像中的讯息,利用Gene Spring GX软件标准化处理和评估CircRNA原始表达讯息。3.利用两分类法进行差异CircRNAs的筛选,火山图及聚类图展示TAD组织中差异CircRNAs的情况。对TAD组织中差异CircRNAs的来源基因进行Go分析,用Arraystar公司的miRNA结合位点预测软件预测差异CircRNAs的5个高匹配值的miRNA结合位点,对差异CircRNAs预测结合的与TAD相关的miRNAs的已验证靶基因进行pathway分析。应用GCBI网站查找miRNA的靶基因。用Cytoscape软件对差异CircRNAs与对应的5个高匹配值结合位点的miRNAs、至少含有一个TAD相关的miRNA的CircRNA/miRNA以及选取结合TAD相关的miRNA 数目最多的 hsa_circRNA_101238 进行 circRNA/miRNA 或circRNA/miRNA/mRNA 网络图构建。4.采用实时荧光定量PCR对CircRNA芯片结果中上调的hsa_circRNA_101238、hsa-_circRNA_104634、hsa-_circRNA_002271、hsa-_circRNA-_102771、hsa-_circRNA_104349,下调的 hsa_circRNA_102683、hsa_circRNA_005525、hsa-_circRNA_103458,线性基因 COL1A1、COL6A3,FLNA 以及hsa-_circRNA-_101238预测结合的hsa-miR-320a的水平进行验证;蛋白免疫印迹检测hsa-miR-320a的靶基因基质金属蛋白酶9的表达。结果:1.HE染色示正常升主动脉具有完整血管结构,TAD患者升主动脉大体标本可见夹层撕裂内膜破口的位置,光镜下,血管结构不完整,可见大量的血细胞成份浸润。免疫组化提示MMP9在TAD组中膜表达明显增加。2.选取的6例急性A型TAD血管与正常升主动脉的标本均符合CircRNA芯片检测的要求。3例A型TAD血管中的RNAOD 260/280的比值分别是1.9、1.89、1.87,3例正常的升主动脉中的RNAOD 260/280的比值分别是1.89、1.89、1.93,所有OD 260/280的比值都大于1.8,而且在1.8-2.1之间,符合实验的基本要求。以Cy3荧光染料对升主动脉标本中的RNA标记,特异性的标记活性为(pmol per uldye)/(ug per ul cRNA),TAD1、TAD2、TAD3 标记效率分别是 23.2、22.5、23.5,NA1、NA2、NA3标记效率分别为23.6、22.5、22.3,符合实验的要求。3.对CircRNA芯片检测的初始数据标准化和低表达的讯息进行过滤后,上述升主动脉标本共检测到CircRNA8173个;CircRNA标准化后数值的质量评估:箱形图的结果分析显示TAD血管与正常血管的CircRNA在各组表达水平的平均值大约在一个水平,数据中间50%的范围值的一致性良好,散点图的结果提示TAD的血管较正常的主动脉存在着大量差异的CircRNAs。4.Volcano Plots的分析检测得到差异的CircRNAs 262个,其中TAD升主动脉中上调的156个,下调的106个。Go分析结果显示,TAD升主动脉中上调circRNAs的线性基因富集总分排名前10的包括negative regulation of cell proliferation,extrcellular matrix organization 等;TAD 升主动脉中下调 circRNAs 的线性基因富集总分排名前 10 的包括:actomyosin structure organization,cytoskeleton organization,cell cycle process,actin cytoskeleton organization,actin filament-based prosess 等。5.在CircRNA/miRNA的注释中,差异的262个CircRNAs预测结合1286个miRNAs,其中包含28个与TAD相关的miRNAs,对这28个miRNAs的已验证靶基因进行pathway分析结果显示富集总分排名前10的信号通路包括focal adhension,regulation of actin cytoskeleton,vascular smooth muscle contraction 等。6.在circRNA/miRNA网络图中,这28个miRNAs对应结合33个CircRNAs中,其中结合TAD相关的miRNAs数目最多的是hsa_circRNA_101238,包括hsa-miR-320a,hsa-miR-320b,hsa-miR-320c;在 circRNA/miRNA/mRNA 构建的网络图中,有46个预测的与TAD相关的靶基因,包括hsa-miR-320a的靶基因 MMP9。7.实时荧光定量PCR结果显示,与正常升主动脉相比,在TAD中hsa-_circRNA_l 01238,hsa-_circRNA_104634,hsa-_circRNA__002271,hsa-_circRNA-_102771,hsa_circRNA-_104349,COL1A1,COL6A3 分别上调3.41,2.96,2.11,2.67,2.6,3.11,2.03 倍,而 hsa_circRNA_102683,hsa_circRNA_005525,hsa_circRNA_103458,FLNA,hsa-miR-320a 分别下调 5.88,5.0,2.94,2.38,2.0倍;WB结果示在TAD升主动脉中MMP9升高1.8倍。结论:1.TAD升主动脉中层撕裂,血栓形成,存在细胞外基质降解。2.与NA相比,TAD的升主动脉存在大量异常表达的CircRNAs,并且与调节细胞外基质、平滑肌细胞丢失病理过程相关。3.CircRNAs可能通过调节亲本基因或作为miRNA海绵分子作用参与TAD的发生发展。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.1

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