脂质筏参与巨噬细胞Raw264.7介导的低密度脂蛋白的氧化
发布时间：2018-02-28 00:13
本文关键词： 低密度脂蛋白 氧化修饰 巨噬细胞 脂质筏 非标记定量蛋白质组学 出处：《武汉大学》2016年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是心血管系统最常见的疾病。氧化修饰的低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)在AS的发生和发展过程中起着重要的作用。而且LDL一旦被氧化,无论被巨噬细胞摄取与否都会表现强烈AS效应,因此,动脉粥样硬化的抗氧化研究势在必行。在体外,LDL的氧化可以被多种抗氧化剂如维生素E和丙丁酚等所完全拮抗。但在体内循环系统中存在大量的抗氧化剂的情况下,LDL仍被氧化。LDL在体内可能是被细胞膜粘附在某个封闭的微环境中,从而避开环境中的抗氧化剂,这就使得临床上抗氧化剂的效果不理想。在前期的实验结果支持下,我们推测脂质筏就是这样的微环境。本论文主要以基于质谱的非标记定量蛋白质组学的技术平台,研究天然LDL不同时间点刺激下巨噬细胞脂质筏中蛋白的变化情况,对LDL的氧化机制进行探讨,本文的研究内容主要包括以下三个方面：1.将LDL(100μg/ml)与巨噬细胞Raw264.7分别孵育5min,15min,30min。激光共聚焦检测脂质筏标志分子GM1的分布情况；荧光漂白恢复技术检测脂质筏的流动性；密度梯度离心分离巨噬细胞脂质筏。实验结果显示：在静息状态下,脂质筏的标志性分子GM1均匀的分布在细胞膜表面,加入LDL之后GM1逐渐聚集,初步证明LDL能够促进巨噬细胞脂质筏的形成；脂质筏含有大量的胆固醇和长链饱和脂肪酸,因此其流动性比普通的细胞膜要差些,于是通过荧光漂白恢复技术我们也发现LDL刺激巨噬细胞以后,GM1荧光淬灭所需要的恢复时间也长一些,这就说明巨噬细胞在经LDL刺激以后细胞膜的流动性降低,究其原因是LDL促进了巨噬细胞的脂质筏的形成,使细胞膜的流动性降低。密度梯度离心分离巨噬细胞脂质筏后,通过免疫印迹实验检测脂质筏标志蛋白Flotillin-1,Caveolin-1的分布得知6-8层为脂质筏,BCA法检测LDL刺激前后脂质筏蛋白含量变化,从图2-4我们可以看出,在LDL刺激后,分离得到的脂质筏中蛋白含量始终是高于未刺激组,正是由于LDL的刺激促进某些分子转位进入到脂质筏中。2.为了研究哪些分子在LDL的刺激下转位进入脂质筏中,采用非标记定量蛋白质组学技术对脂质筏相关蛋白进行分析。利用DAVID数据库对差异蛋白进行GO条目富集分析以及蛋白相互作用分析。实验结果显示：我们发现脂质筏相关蛋白呈现出4种变化模式：(1)180个蛋白在LDL不同时间点刺激下其在脂质筏中的含量均上升；(2)63个蛋白含量在LDL刺激5分钟或者15分钟下调,随后又上升；结果见附表一；(3)147个蛋白在LDL不同时间点刺激下其在脂质筏中的含量均下调；(4)48个蛋白的含量在LDL刺激5分钟或者15分钟上升,随后又下调。涉及氧化还原、脂质分解过程、白细胞粘附、跨膜转运、白细胞趋化、脂质堆积、内吞、蛋白转运、生物粘附、氧化应激等过程显著富集。而通过String数据库分析,建立了差异蛋白相互作用网络图,许多蛋白的相互作用引起我们高度关注,如ERp29与calreticulin。本章中对质谱数据的分析为后面筛选与LDL氧化相关的蛋白奠定基础。3.基于脂质筏蛋白质组学的LDL氧化相关因子的筛选及功能研究。从LDL粘附于巨噬细胞到酶的激活,并经分泌找到LDL对其进行氧化,这之间的生物化学过程大致分为3个部分：(1)LDL的粘附,(2)信号传导,(3)酶的激活及定向分泌。我们按照以上3个生物化学过程筛选LDL氧化相关蛋白,最终确定ERp29作为目标分子。首先采用免疫印迹验证质谱数据的可靠性,再利用siRNA的方法探讨ERp29与巨噬细胞介导的LDL氧化之间的关系。实验结果显示：用p-环糊精来破坏巨噬细胞脂质筏结构后,其氧化LDL的能力下降并且抑制了ERp29蛋白向脂质筏的转位,初步证明了脂质筏对LDL的氧化以及ERp29蛋白的转位是必须的,随后,我们利用siRNA下调细胞内ERp29的表达,图4-3A显示,siRNA干扰后的巨噬细胞的氧化LDL的能力下降,表现为TBARS值在细胞与LDL孵育24时明显减少,进一步研究其机制发现ERp29能够通过抑制Nox2向脂质筏的转位来影响NADPH酶的装配从而降低细胞内ROS水平,最终引起巨噬细胞介导LDL氧化能力的下降。
[Abstract]:鍔ㄨ剦绮ユ牱纭寲(Atherosclerosis, AS)鏄績琛，
本文编号：1544930
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xxg/1544930.html
最近更新
教材专著
