周期性牵张力对血管平滑肌细胞增殖、迁移及胶原代谢的影响及其机制研究

发布时间：2018-03-03 05:26

  本文选题：机械牵张力　切入点：血管紧张素转换酶2　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：1.研究背景研究报道,心血管疾病已经严重危害人类健康,并且威胁人类的生命。高血压是心血管疾病主要危险因素之一。目前,我国高血压患者已突破3.3亿。由高血压造成的血管结构和功能异常是心血管疾病的主要病理学基础。高血压发生的同时往往伴有血管壁机械牵张力的增加。平滑肌细胞作为机械牵张力的靶细胞,其形态和功能随着机械牵张力的升高而发生改变,从而引起血管形态和功能的异常。研究认为,机械牵张力刺激血管平滑肌细胞时,机械刺激信号可通过平滑肌细胞表面的各种离子通道、受体分子等转化为细胞内的生物学信号,进一步影响平滑肌细胞的生物学功能。通常,我们将生理状态下血管壁受到的牵张力(9%-12%elongation)称之为生理性牵张力,可抑制平滑肌细胞的增殖、迁移,维持其收缩表型,维持血管正常的结构和功能；而在高血压、动脉粥样硬化等病理情况下,血管壁受到的牵张力升高(15% elongation),我们称之为病理性牵张力,可促进平滑肌细胞的增殖、迁移,促进血管重构的发生。肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)与心血管疾病关系密切。血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme, ACE)可催化血管紧张素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ)产生血管紧张素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)。Ang Ⅱ是RAS系统的重要效应分子,与其受体AT1R及AT2R结合发挥生物学效应。近年来,随着RAS系统新成员-血管紧张素转化酶2(ACE2)的发现,为深入研究RAS系统与心血管疾病的关系提供了新思路。ACE2是ACE的同系化合物,其结构与ACE相似,是一种锌离子依赖的金属蛋白酶。到目前为止,ACE2主要有两大生理功能：(1)催化血管紧张素Ⅱ转化为血管紧张素1-7；(2)催化血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素1-9,血管紧张素1-9可进一步被ACE降解为血管紧张素1-7。研究表明,血管紧张素1-7是一种与血管紧张素Ⅱ有相反作用的血管紧张素家族的终末活性产物。因而,ACE2被认为是RAS系统的负性调节因子。研究证明,力学刺激信号可以调节ACE2的表达,同时ACE2在心血管重构中有保护作用。那么,ACE2在机械牵张力调节血管平滑肌细胞功能中是否发挥作用,将是我们重点讨论的问题。机械牵张力在调节血管平滑肌细胞功能中发挥重要作用,同时ACE2亦参与对平滑肌细胞功能的调节,因而我们提出以下科学假说：(1)周期性牵张力调节人主动脉平滑肌细胞ACE2的表达；(2)周期性牵张力影响包括ACE2在内的RAS系统各主要成分的表达,ACE2-Ang-(1-7)轴与ACE-Ang Ⅱ轴相互制约、相互影响,共同参与病理性牵张力(18% elongation, 1Hz)对人主动脉平滑肌细胞生物学作用的影响。2.研究目的：(1)探讨周期性牵张力对血管平滑肌细胞ACE2表达的影响；(2)明确ACE2在病理性牵张力(18% elongation, 1Hz)调节人主动脉平滑肌细胞生物学功能中的作用；(3)明确病理性牵张力(18% elongation, 1Hz)调节血管平滑肌细胞ACE2表达的分子机制。3.研究方法3.1.人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)培养与处理3.1.1.平滑肌细胞培养人主动脉平滑肌细胞株购自美国菌种保藏中心ATCC (American Type CellCollection),待平滑肌细胞生长至完全融合后,用吸管吸掉旧培养基,PBS冲洗细胞两遍,在细胞培养瓶中加入适量事先预热的0.25%胰蛋白酶,显微镜下观察,至平滑肌细胞变圆后,轻轻拍打至细胞脱落,加入适量完全培养基中和胰酶,吹打细胞,使平滑肌细胞全部掉落,离心5min (1000r/min)。离心结束,用吸管吸掉上清,加入新的完全培养基,转入新的细胞培养瓶中,将培养瓶放入含5%C02的37℃细胞培养箱中继续培养。待平滑肌细胞贴壁完全后,显微镜下观察细胞形态及密度。3.1.2.平滑肌细胞干预体外培养的4-7代HASMCs用于实验。将平滑肌细胞种至铺有Ⅰ型胶原的Flexcell六孔板中。待平滑肌细胞在六孔板中的密度达到80%-90%时,更换无血清SMCM继续培养24小时。牵张力刺激平滑肌细胞前再次更换新的完全培养基。在37。C,5% C02条件下,使用Flexcell 5000-Tension系统刺激平滑肌细胞。不同牵张力描述如下：(1)生理性牵张力:10% elongation,频率为1Hz；(2)病理性牵张力：18% elongation,频率为1Hz。3.2.动物模型的建立我们应用大鼠腹主动脉缩窄模拟血管压力负荷升高,20只雄性Wistar大鼠(200-250g)随机分为两组：腹主动脉缩窄组(n=10)和对照组(n=10),分别于术后3、5及7天后取材。3.3.实时荧光定量PCR分析刺激结束后利用Trizol法提取平滑肌细胞中的总RNA,并测定RNA浓度。根据试剂盒说明,使用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒进行逆转录反应,再使用TaKaRa公司的实时定量PCR试剂盒进行PCR反应。反应结束后得到Ct值,用相对定量的方法计算2-△△Ct,并分析数据。以测定平滑肌细胞内ACE2及ACE的mRNA表达情况。3.4.蛋白质印迹法(Western Blot)提取不同刺激后的平滑肌细胞及大鼠组织蛋白,4摄氏度离心10分钟,99摄氏度晃动加热10分钟,SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭,4摄氏度一抗孵育过夜,室温下二抗孵育2小时,ECL化学发光,利用Photoshop分析对应蛋白条带的灰度值。3.5.ACE2活性测定刺激结束后,提取平滑肌细胞蛋白,以7-Mca-YVADAPK(Dnp)作为反应底物测定不同刺激条件下ACE2的活性变化情况。3.6.酶联免疫吸附测定(ELISA)收集不同刺激条件下平滑肌细胞上清液,ELISA法检测上清中血管紧张素1-7及血管紧张素Ⅱ的含量。3.7.构建含目的基因的病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建过表达ACE2基因腺病毒载体(Ad-ACE2),以携带绿色荧光蛋白的腺病毒空载体(Ad-GFP)为对照组。3.8.5-澳脱氧尿嘧啶核苷法(BrdU)用Brdu法检测ACE2在病理性牵张力(18% elongation,1Hz)调节HASMCs增殖中的作用。将HASMCs种在Flexcell六孔板中,进行不同刺激。刺激结束后,吸掉旧SMCM,加入适量配制好的BrdU labeling medium作用6小时。将平滑肌细胞用95%7,醇在-20摄氏度固定30分钟,经anti-Brdu working solution4摄氏度孵育过夜、anti-mouse-Ig-fluorescein标记的二抗37摄氏度避光孵育30分钟,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diaxnidino-2-Phenylindole, DAPI)染核后封片,光学显微镜下观察、拍照。3.9.细胞划痕实验用细胞划痕实验检测ACE2在病理性牵张力(18% elongation, 1Hz)调节HASMCs迁移中的作用。3.10.细胞转染利用Invitrogen公司的Lipofectamine2000分别转染不同浓度的Dicer siRNA、 ATF3 siRNA、Negtive control siRNA及miR-421 inhibitor和mimics,观察ACE2mRNA及蛋白的表达变化,验证ATF3及miR-421是否参与ACE2表达调节。DicersiRNA、ATF3 siRNA、Negtive control siRNA及miR-421 inhibitor和miR-421 mimics均由上海吉玛公司合成。3.11.构建含有ACE2-3'-UTR的荧光素酶报告基因质粒分别构建含有野生型ACE2基因的3'端非编码区序列(3'-UTR)和突变型ACE2基因的3'端非编码区序列(3'-UTR)的荧光素酶报告基因质粒(pGL3)：ACE2-3'-UTR-WT和ACE2-3'-UTR-MUT。通过Lipofectamine 2000,将miR-421mimics和ACE2-3'-UTR-WT或ACE2-3'-UTR-MUT共转染人胚肾细胞(Human Embryonic Kidney 293 cells, HEK293),检测荧光表达强度。明确miR-421与ACE2基因的3端非编码区的结合。3.12.组织学染色收集各组大鼠腹主动脉,制备石蜡切片。应用免疫组织化学染色,观察血管组织内ACE2及ACE的分布及表达情况。3.13.统计学分析实验所得数据均以均数±标准差表示,采用SPSS软件进行统计分析。两组之间的统计分析采用非配对t检验,多组之间的统计分析采用单因素方差分析,P0.05代表统计学有显著性差异。4.结果4.1.周期性牵张力对平滑肌细胞内ACE2、ACE、Ang(1-7)、Ang Ⅱ表达的影响在时间-效应实验中,18%机械牵张力能够抑制ACE2的表达,在12小时时间点达到最大抑制效应(p0.01),同时ACE2的活性下降(p0.05)；而18%机械牵张力促进ACE的表达(p0.05),其mRNA于刺激后12小时达到峰值(p0.01)；18%机械牵张力作用3、6小时后,Ang Ⅱ、Ang (1-7)水平比0小时对照组无明显变化,18%牵张力作用12h后,Ang Ⅱ水平显著增加(P0.01),而Ang(1-7)水平显著降低(P0.01),且这一趋势持续至机械牵张力刺激24小时。在张力-效应实验中,与静止对照组相比,18%机械牵张力刺激12小时后,ACE2表达下降(p0.05)、活性降低(p0.05)；与生理牵张力刺激组相比,18%牵张力刺激12小时后,ACE2表达下降(p0.05)、活性降低(p0.01)。而18%牵张力作用12小时后,其ACE表达比静止对照组显著增加(p0.01),比生理牵张力刺激组亦显著增加(p0.01)。与静止对照组相比,18%牵张力干预平滑肌细胞12小时后,Ang Ⅱ水平升高明显(P0.01),而Ang(1-7)水平降低明显(P0.01)；与生理牵张力刺激组相比,Ang Ⅱ水平亦升高明显(P0.01),Ang(1-7)水平亦降低明显(P0.01)。4.2.体内试验验证压力负荷对血管平滑肌细胞ACE2及ACE表达的影响免疫组化结果显示：与假手术组相比,大鼠腹主动脉缩窄5及7天后,ACE2表达下降(P0.01)；而大鼠腹主动脉缩窄7天后,ACE表达升高(P0.01)。WesternBlot结果显示：与假手术组相比,大鼠腹主动脉缩窄5及7天后,ACE2表达下降(P0.01)；而ACE表达升高(P0.01)。4.3.ACE2对病理性牵张力调节平滑肌细胞增殖、迁移及胶原代谢的影响Brdu掺入法结果提示：与Ad-GFP组相比,Ad-GFP+stretch组促进平滑肌细胞的增殖(P0.01)；与Ad-GFP+stretch组相比,Ad-ACE2+stretch组抑制平滑肌细胞增殖(P0.05)。细胞划痕试验表明：与Ad-GFP组相比,Ad-GFP+stretch组促进平滑肌细胞的迁移(P0.01)；与Ad-GFP+stretch组相比,Ad-ACE2+stretch组抑制平滑肌细胞迁移(P0.05)。Westerb Blot结果提示：与Ad-GFP组相比,Ad-GFP+stretch组胶原表达升高(P0.05)；与Ad-GFP+stretch组相比,Ad-ACE2+stretch组胶原表达没有明显变化(P0.05)。以上结果表明, ACE2参与病理性牵张力(18% elongation,1Hz)对平滑肌细胞增殖、迁移的调节,但是不参与对胶原代谢的调节。4.4.p38参与病理性牵张力对ACE2的调节作用病理性牵张力(18% elongation,1Hz)使得磷酸化p38及磷酸化JNK水平升高(p0.05),而对磷酸化ERK的表达没有影响(P0.05)。我们应用ERK1/2抑制剂(PD98059)、JNK抑制剂(SP600125)和p38抑制剂(SB203580)干预病理性牵张力(18% elongation,1Hz)刺激。检测发现SB203580能够阻断病理性牵张力对ACE2的下调作用(P0.05)。表明p38参与病理性牵张力对ACE2表达的调节。4.5.ATF3参与病理性牵张力对ACE2的调节作用将ATF3的siRNA转染入HASMCs中将其沉默,Western Blot结果显示：与阴性对照组相比,ATF3的干扰可阻断病理性牵张力对ACE2的下调(P0.01),表明ATF3参与病理性牵张力(18% elongation,1Hz)对ACE2的下调作用。4.6.miR-421参与病理性牵张力对ACE2的调节作用将Dicer siRNA转染入HASMCs中沉默Dicer酶后,ACE2表达升高,表明microRNA参与对ACE2表达的调节。应用TargetScan, microCosm等著名的MicroRNA分析预测软件,确定ACE2是miR-421的潜在靶基因。转染miR-421mimics或miR-421 inhibitor后,平滑肌细胞内ACE2的表达水平显著降低或升高。将miR-421 mimics与ACE2-3'-UTR-WT共转染HEK293细胞后,荧光强度显著降低。给予18%牵张力刺激,发现miR-421水平升高。将平滑肌细胞转染miR-421mimics后,再给予18%牵张力刺激,发现ACE2表达水平显著降低。表明miR-421参与病理性牵张力对ACE2的调节作用。5.结论(1)病理性牵张力抑制ACE2及Ang(1-7)的表达,促进ACE及Ang Ⅱ的表达；(2)ACE2参与病理性牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移的调节,不参与对胶原代谢的调节；(3) p38、ATF3及miR-421参与病理性牵张力对ACE2的调节作用。1.研究背景血管一直暴露于血流动力学的作用下,异常的血流动力学,例如血压增高状态下,容易引起血管重构。血管重构主要表现为血管功能、血管管腔面积及形态、血管壁细胞和细胞外基质的重构。胶原作为细胞外基质的主要成分,其合成和降解过程与血管重构密切相关。4-羟基-脯氨酸羟化酶(Prolyl 4-Hydroxylase,P4H)是胶原合成过程中的关键酶,能够催化位于X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-Gly)中的脯氨酸变为羟脯氨酸,该反应在胶原形成稳定三螺旋结构的过程中发挥重要作用。而P4H由2个α亚基和2个p亚基组成,α亚基是胶原合成过程中的重要限速酶,可决定酶的活性。过表达P4H则导致胶原的合成增多,而抑制P4H的表达会导致胶原的降解和不稳定。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)可降解多种细胞外基质成份,其在病理及生理的细胞外基质重塑中起到重要作用。MMPs的活性受到多方面的调节：转录水平调节、分泌酶原的活化及基质金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteases, TIMPs)的抑制。我们的前期研究发现病理性牵张力(18% elongation,1HZ)促进人主动脉平滑肌细胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells, HASMCs)胶原蛋白的表达,而ACE2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)并不参与其中,那么病理性牵张力是否通过P4H和MMPs影响胶原蛋白的代谢?ACE2是否可以影响平滑肌细胞内P4H和MMPs的表达?有待于我们进一步的研究。细胞膜表面的酪氨酸激酶受体(Receptor tyrosine kinase, RTKs)、整合素(Integrin)、离子通道等结构均可以将胞外力学刺激转化为胞内生化信号,激活PI3K/Akt、MAPKs、PKC等多种信号分子,活化多种转录因子,通过改变细胞增殖、调亡、表型转化、细胞外基质代谢等有关基因的表达而影响细胞功能。前期研究发现,PI3K/Akt通路参与血管平滑肌细胞MMP-2的表达。机械牵张力通过MAPKs信号通路调节血管平滑肌细胞的不同功能。我们实验室发现,ox-LDL通过p38和ERK 1/2抑制P4Hα1的表达,ASK1-JNK通路参与肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)对P4Hα1的抑制作用。那么病理性牵张力是否通过PI3K/Akt和MAPKs信号通路调节HASMCs MMPs及P4H的表达,尚需要进一步的明确。为了观察高血压状态下血管壁胶原的重构过程,我们研究了病理性牵张力(18%elongation,1HZ)引起MMPs和P4H的变化及相关机制,探讨了病理性牵张力对胶原代谢的影响。2.研究目的：(1)探讨周期性牵张力对血管平滑肌细胞P4Hα1、MMPs、TMP-1、TIMP-2及胶原表达的影响；(2)明确病理性牵张力(18% elongation,1 HZ)调节血管平滑肌细胞P4Hα1及MMP-2表达的分子机制；(3)研究ACE2对血管平滑肌细胞P4Hα1、MMP-2表达的影响。3.研究方法：3.1.人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)培养人主动脉平滑肌细胞株购自美国菌种保藏中心(ATCC),待平滑肌细胞生长至完全融合后,用吸管吸掉旧SMCM,PBS冲洗细胞两遍后,在细胞培养瓶中加入事先预热的0.25%胰蛋白酶,拧紧瓶盖,显微镜下观察,待平滑肌细胞变圆后,轻轻震荡至细胞脱落,加入适量培养基中和胰酶,吹打细胞,使平滑肌细胞掉落,移至离心管中,离心5min (1000r/min)。离心结束,弃掉上清,加入新的完全培养基,转入新的培养瓶放入含5% C02的37℃细胞培养箱中继续培养。第4-7代HASMCs用于实验。3.2.平滑肌细胞处理体外培养的4-7代HASMCs用于实验。将平滑肌细胞种至铺有Ⅰ型胶原的Flexcell六孔板中。待平滑肌细胞在六孔板中的密度达到800%-90%时,更换无血清SMCM继续培养24小时。牵张力刺激平滑肌细胞前再次更换新的完全培养基。在37。C,5%C02条件下,使用Flexcell 5000-Tension系统刺激平滑肌细胞。不同牵张力描述如下：(1)生理性牵张力：10% elongation,频率为1Hz；(2)病理性牵张力：18% elongation,频率为1Hz。3.3.动物模型的建立20只雄性Wistar大鼠(200-250g)随机分为两组：腹主动脉缩窄组(n=10)和对照组(n=10)。分别于术后3、5、7天取材。3.4.实时荧光定量PCR分析刺激结束后利用Trizol法提取细胞中的总RNA,用紫外分光光度仪测定RNA浓度。根据TaKaRa公司的试剂盒操作说明,使用cDNA合成试剂盒进行逆转录反应,再使用TaKaRa公司的实时定量PCR试剂盒进行PCR反应。反应结束得到Ct值,用相对定量的方法计算2-△△Ct,并分析数据。以测定P4Hα1、MMP-2、 TIMP-1及TIMP-2的mRNA表达情况。3.5.蛋白质印迹法(Western Blot)提取不同刺激后的细胞或组织蛋白,4℃离心10分钟,99℃晃动加热10分钟,SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭,4℃一抗孵育过夜,室温下二抗孵育2小时,化学发光,分析对应的蛋白条带的灰度值。3.6.酶联免疫吸附测定(ELISA)刺激结束后,收集平滑肌细胞上清,ELISA检测其中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量。3.7.明胶酶谱采用明胶酶谱法检测HASMCs及大鼠血管平滑肌细胞中MMP-2和MMP-9的活性。3.8.组织学染色收集各组大鼠腹主动脉,制备石蜡切片,进行Masson染色,显示血管壁胶原的含量。应用免疫组织化学染色,观察血管组织内P4Hα1、MMPs、TIMP-1及TIMP-2的分布及表达情况。3.9.统计学分析实验所得数据均以均数±标准差表示,采用SPSS软件进行统计分析。两组之间的统计分析采用非配对t检验,多组之间的统计分析采用单因素方差分析,P0.05代表统计学有显著性差异。4.研究结果4.1.病理性牵张力对人主动脉平滑肌细胞内P4Hα1、MMPs及TIMPs表达的影响在时间-效应实验中,病理性牵张力(18% elongation,1HZ)能够促进P4Hα1的表达,在12小时时间点达峰(p0.05)。明胶酶谱法检测MMPs的活性,发现18%牵张力刺激可以增加HASMCs中MMP-2的活性(p0.05),但在该实验中未能检测出MMP-9的活性。RT-PCR及Western blot检测发现,病理性牵张力能够促进MMP-2的表达(p0.05)。而病理性牵张力刺激对TIMP-1及TIMP-2的表达没有明显影响(p0.05)。在张力-效应实验中,与静止对照组及生理牵张力刺激组相比,病理性牵张力刺激12小时后,P4Hα1显著升高(p0.01)。应用明胶酶谱法检测,10%及18%牵张力均能升高平滑肌细胞内MMP-2的活性(p0.01),而与10%牵张力组相比,18%牵张力升高MMP-2活性的程度更为明显(p0.01)。RT-PCR及Westernblot结果提示,与静止对照组及生理牵张力刺激组相比,18%机械牵张力能够促进MMP-2的表达(p0.05)。同样,10%及18%牵张力刺激平滑肌细胞12小时后,平滑肌细胞内TIMP-1及TIMP-2的表达没有明显影响(p0.05)。4.2.病理性牵张力对人主动脉平滑肌细胞内胶原表达的影响应用ELISA及Western blot检测平滑肌细胞内胶原蛋白的表达水平。结果提示,病理性牵张力(18% elongation,1Hz)刺激平滑肌细胞12小时后,胶原Ⅰ及胶原Ⅲ的表达水平显著升高(p0.05)。4.3.MMP-2及P4Ha1参与病理性牵张力对胶原代谢的影响我们应用siRNA干扰MMP-2及P4Ha1的表达,发现MMP-2 siRNA及P4Hα1siRNA能升高或降低病理性牵张力(18% elongation,1Hz)引起的胶原蛋白的表达,证明在病理性牵张力作用下,MMP-2及P4Hα1参与对胶原的调节。4.4.体内试验验证压力负荷对血管平滑肌细胞P4Hα1、MMPs、TIMPs及胶原表达的影响应用明胶酶谱法检测发现,大鼠腹主动脉缩窄7天后MMP-2的活性显著增加(p0.05),但未能检测出MMP-9的活性。免疫组化及Western blot结果显示：与假手术组相比,大鼠腹主动脉缩窄后,P4Ha1及MMP-2表达升高(p0.05),而TIMP-1及TIMP-2的表达没有明显变化(p0.05)。应用Mssson染色及Western blot检测压力负荷增加对胶原蛋白的影响,结果提示大鼠腹主动脉缩窄后血管内胶原含量增加(p0.05)。4.5.Akt在病理性牵张力调节平滑肌细胞MMP-2及P4Ha1表达中的作用病理性牵张力(18% elongation,1Hz)使得磷酸化Akt水平升高(p0.05)。给予平滑肌细胞Akt抑制剂LY294002预处理1小时,然后给予18%牵张力刺激12小时,发现LY294002预处理可降低病理性牵张力诱导的MMP-2表达上调及活性升高(P0.05),却并不降低牵张力诱导的P4Hα1表达上调(P0.05)。表明Akt参与病理性牵张力对MMP-2表达的调节,不参与对病理性牵张力对P4Hα1表达的调节。4.6. MAPKs在病理性牵张力调节平滑肌细胞MMP-2及P4Ha1表达中的作用病理性牵张力(18% elongation,1Hz)使得磷酸化p38及磷酸化JNK水平升高(p0.05),而对磷酸化ERK的表达没有影响(P0.05)。我们应用MAPKs的抑制剂SB203580、SP600125和PD98059干预病理性牵张力(18% elongation,1Hz)刺激。检测发现SB203580、SP600125和PD98059对病理性牵张力促进MMP-2表达的作用没有明显影响(P0.05),对升高MMP-2活性的作用亦没有明显影响(P0.05)。然而,SB203580和SP600125能够阻断病理性牵张力对P4Hα1的上调作用(P0.01)。表明MAPKs不参与病理性牵张力对MMP-2表达的调节,p38和JNK参与病理性牵张力对P4Hα1表达的调节。4.7ACE2对MMP-2及P4Ha1表达的影响我们前期研究发现,ACE2不参与病理性牵张力(18% elongation,1Hz)对胶原代谢的调节。而MMP-2和P4Hα1参与病理性牵张力对胶原代谢的影响。本研究探讨了ACE2对MMP-2及P4Hα1表达的影响。应用siRNA干扰ACE2的表达,发现ACE2 siRNA对平滑肌细胞内MMP-2和P4Hαl的表达没有明显影响(P0.05),进一步表明了ACE2不参与病理性牵张力对胶原代谢调节的作用。5.结论(1)病理性牵张力(18% elongation,1Hz)上调P4Hα1、MMP-2及胶原的表达,对TMP-1和TIMP-2的表达没有影响；(2)18%牵张力通过激活Akt和p38 MAPK-JNK信号通路促进MMP-2、 P4Hα1的表达。(3)MMP-2及P4Hα1参与病理性牵张力对胶原代谢的影响,ACE2不参与病理性牵张力对胶原代谢的影响,且ACE2对不影响平滑肌细胞内MMP-2和P4Hal的表达。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
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本文编号：1559734