Apelin-13诱导自噬促进泡沫细胞胆固醇流出的作用及机制

发布时间：2018-03-09 16:40

本文选题：apelin-13　切入点：自噬　出处：《南华大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)性心脑血管疾病是一类严重危害人类健康和生命的重大疾病,其发生机制涉及炎症、损伤应答和脂质代谢异常等众多因素。其中单核细胞分化为巨噬细胞,吞噬脂蛋白源性的过量胆固醇,进而在血管壁上形成泡沫细胞,是动脉粥样硬化发病过程中的一个关键事件。自噬(autophagy)是细胞利用溶酶体系统降解细胞聚集蛋白、受损细胞器和各种大分子物质的过程。近年研究表明自噬与As紧密相关,一种自噬特殊形式—脂噬(lipophagy),能将巨噬细胞内胆固醇酯(cholesterol ester,CE)运输至溶酶体,被溶酶体脂酶降解后通过细胞膜蛋白三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)运送至高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL),促进巨噬细胞内胆固醇流出。因此自噬是促进细胞胆固醇流出和防治动脉粥样硬性心血管疾病的一个潜在靶标。Apelin是脂肪细胞分泌的一种脂肪因子,具有生物活性的肽类激素,在体内组织分布广泛,尤其在心血管组织高表达。它与其受体构成Apelin/APJ系统,主要参与血管氧化应激反应过程,对心血管系统有重要的调节作用。体内常见的有apelin-36、17、13、和12等几种形式,其中生物活性最强是apelin-13。在心血管疾病患者血浆中apelin水平比正常人显著下降,并与动脉粥样斑块的发展及稳定密切相关。提示apelin具有抗动脉粥样硬化作用,但具体机制尚未明了。自噬的过程及其机制复杂,受许多信号通路调控,其中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3Ks)是自噬途径中的关键调节分子。其中Class I PI3K和Class III PI3K信号途径在不同时期调控自噬作用。新近研究发现apelin通过PI3Ks信号通路诱导自噬参与细胞的保护作用,提示apelin抗As作用与自噬密切相关。本研究从自噬入手,并通过不同方法干预PI3Ks信号途径,观察其对apelin-13作用的影响,以探讨apelin-13与自噬之间的作用关系及信号传导机制,从而为揭示apelin-13在动脉粥样硬化发生发展中的可能作用和机制提供新的研究思路。第一部分Apelin-13通过诱导自噬对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响目的:观察apelin-13对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和自噬的作用,同时观察apelin-13调控自噬变化对细胞胆固醇流出的影响。方法:培养THP-1单核细胞,用佛波酯(phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)诱导THP-1细胞贴壁分化为巨噬细胞。THP-1源性巨噬细胞与ox-LDL共孵育分化、形成泡沫细胞,得到巨噬细胞源性泡沫细胞模型。用apelin-13处理泡沫细胞,观察apelin-13对胆固醇流出、自噬相关蛋白表达影响的浓度效应和时间效应。分别用液体闪烁计数法、油红O染色及高效液相色谱法检测细胞内胆固醇的流出、脂滴及胆固醇水平。构建荧光真核表达载体pc DNA3.1-GFP-LC3,转染巨噬细胞,通过荧光显微镜观察各组细胞中自噬体形成情况,采用Western blotting免疫印迹分别检测细胞中LC3和p62蛋白质的表达。用apelin抑制剂百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)、自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin)、自噬抑制剂长春花碱(vinblastine)对apelin-13作用下的细胞共处理,检测细胞内自噬活性,并观察细胞内脂质蓄积和胆固醇流出的影响。结果:不同浓度的apelin-13(0,1,10,100 n M apelin-13)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24h后,液体闪烁计数法检测发现细胞内胆固醇流出增多。高效液相色谱法检测显示细胞内胆固醇含量明显减少,同时油红O也证实细胞内脂滴明显减少,并且以上效应呈浓度依赖性。Western blotting检测自噬蛋白的表达,结果显示,apelin-13可呈浓度依赖性上调细胞LC3蛋白的表达,而下调p62表达。以100 n M apelin-13不同时间(0,6,12,24小时)分别处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,结果发现,细胞内脂滴蓄积明显降低,细胞内胆固醇含量显著减少,细胞内流出的胆固醇明显增加,且随时间的延长,效应越明显,提示apelin-13的作用呈时间依赖性。Western blotting免疫印迹检测发现细胞中LC3蛋白表达呈时间依赖性的上调,p62表达呈时间依赖性下调。Apelin抑制剂PTX预处理细胞后,apelin-13对上述的效应随即取消。自噬激动剂rapamycin预处理细胞后,增强apelin-13对细胞的自噬,增加了自噬体数量,促进了细胞内胆固醇流出,减少细胞内脂质蓄积。而自噬抑制剂vinblastine预处理细胞后,减弱apelin-13对细胞自噬的影响,减少了自噬体数量,抑制了细胞内胆固醇流出,促进细胞内脂质蓄积。结论:(1)apelin-13呈浓度依赖性和时间依赖性的方式促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇的流出,减少细胞内胆固醇的蓄积;(2)apelin-13以时间依赖性和浓度依赖性的方式上调LC3、下调p62表达,促使自噬体形成。(3)apelin-13通过自噬,增加巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出,减少脂质蓄积,抑制泡沫细胞的形成。第二部分Apelin-13通过诱导自噬对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的分子机制目的:探讨apelin-13诱导THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞自噬和促进细胞内胆固醇流出的分子机制。方法:培养THP-1细胞株,以佛波酯(phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)和ox-LDL诱导分化并形成泡沫细胞,复制巨噬细胞源性泡沫细胞模型。采用apelin-13和(或)Class I PI3K及Class III PI3K信号途径中关键分子的相关抑制剂和RNA干扰等共同处理细胞,以液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇的流出率,Western blotting分别检测细胞中自噬蛋白LC3和p62的表达,并检测Class I PI3K和Class III PI3K信号途径各关键蛋白的表达。结果:不同浓度的apelin-13(0,1,10,100 n M apelin-13)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24h后,Western blotting结果显示,apelin-13浓度依赖性下调Class I PI3K蛋白的表达、下调Akt和m TOR磷酸化和上调PTEN和ULK1蛋白表达;采用PTEN特异抑制剂SF1670处理细胞,结果发现,与对照组相比,SF1670单独处理组LC3-Ⅱ/LC3-I比值下降,上调了p62的表达;与apelin-13组相比,SF1670预处理细胞再加入apelin-13相比,LC3-Ⅱ/LC3-I比值下降,p62表达上调。液体闪烁计数法检测结果显示,与对照组相比,SF1670可减少细胞胆固醇的流出;与单独用apelin-13处理组的细胞比较,apelin-13与SF1670共处理细胞,可以减少细胞胆固醇的流出;ULK1的si RNA处理细胞后,结果显示,与Control-si RNA组相比,Control-si RNA加apelin-13共同处理组LC3-Ⅱ/LC3-I比值上调,p62蛋白表达下调;与Control-si RNA加apelin-13共同处理组相比,而ULK1-si RNA组加apelin-13组,LC3-Ⅱ/LC3-I比值显著下降,p62表达显著上调,液体闪烁计数法检测细胞胆固醇的流出率。结果显示,与Control-si RNA组相比,Control-si RNA加apelin-13共同处理增加细胞胆固醇的流出。与Control-si RNA加apelin-13共同处理组相比,而ULK1-si RNA组加apelin-13组明显抑制细胞胆固醇的流出。同时结果显示apelin-13呈剂量依赖性上调了Class III PI3K和Beclin-1表达。Class III PI3K特异抑制剂3-MA处理细胞,结果发现,与对照组相比,单独3-MA处理下调LC3-Ⅱ/LC3-I比值,上调了p62的表达,与apelin-13组相比,与3-MA预处理细胞再加入apelin-13相比,LC3-Ⅱ/LC3-I比值下调,p62上调,液体闪烁计数法检测细胞胆固醇的流出率。结果显示,与对照组相比,3-MA可减少细胞胆固醇的流出。与单独用apelin-13处理组的细胞比较,apelin-13与3-MA共处理细胞,可以减少细胞胆固醇的流出。Beclin-1si RNA处理细胞后,结果显示,与Control-si RNA组相比,Control-si RNA加apelin-13共同处理组LC3-Ⅱ/LC3-I比值上调,p62蛋白表达下调;与Control-si RNA加apelin-13共同处理组相比,而Beclin-1-si RNA组加apelin-13组,LC3-Ⅱ/LC3-I比值显著下降,p62表达显著上调,液体闪烁计数法检测细胞胆固醇的流出率。结果显示,与Control-si RNA组相比,Control-si RNA加apelin-13共同处理增加细胞胆固醇的流出。与Control-si RNA加apelin-13共同处理组相比,而Beclin-1-si RNA组加apelin-13组明显抑制细胞胆固醇的流出。结论:(1)apelin-13抑制Class I PI3K信号途径关键蛋白,促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇的流出,减少细胞内胆固醇的蓄积;(2)apelin-13激活Class III PI3K信号途径关键蛋白表达,促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇的流出,减少细胞内胆固醇的蓄积。第三部分Apelin-13调控自噬对apo E~(-/-)小鼠胆固醇逆向转运、动脉壁脂质蓄积和动脉粥样硬化病变的影响目的:以apo E~(-/-)小鼠为实验对象进行体内研究,观察apelin-13对apo E~(-/-)小鼠体内RCT、血脂水平、主动脉壁内脂质蓄积、As病变及自噬水平的影响。初步探讨其作用机制。方法:6周龄雄性apo E~(-/-)小鼠随机分成4组(每组15只),以高脂/高胆固醇(high-fat/high-cholesterol diet,HF/HC,79.5%标准饲料、0.5%胆酸钠、4%奶粉、2%胆固醇、10%猪油和4%蛋黄粉配制)饲料饲养。其中,对照组(Con group)仅饲以高脂/高胆固醇饮食,隔天腹腔注射与实验组同等剂量的生理盐水;apelin-13(APLN group)组除饲以高脂/高胆固醇饮食外,隔天腹腔注射apelin-13(剂量1μg/kg);PTX+apelin-13组(PTX+APLN group)除饲以高脂/高胆固醇饮食外,隔天腹腔注射PTX(剂量4 mg/kg)4h后再注射apelin-13(剂量1μg/kg);PTX(PTX group)组除饲以高脂/高胆固醇饮食外,隔天腹腔注射PTX(剂量剂量4 mg/kg)。8周后处死动物,体视显微镜下观察血管As形成情况;HE染色观察主动脉窦处斑块形成情况;油红O染色观察主动脉和主动脉窦As病变处脂质蓄积情况;Masson氏染色法检测斑块胶原纤维面积;液体闪烁计数仪测定小鼠腹腔巨噬细胞(mouse peritoneal macrophage,MPM)来源的胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transportation,RCT)效率;;全自动生化分析仪检测甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平;高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法检测apo E~(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞中脂质水平;Western blot法检测小鼠主动脉组织和腹腔巨噬细胞内蛋白质的表达。结果:(1)主动脉体视显微镜观察结果显示,apelin-13组小鼠主动脉内斑块较对照组显著减少,而PTX+apelin-13组小鼠主动脉内斑块较apelin-13组显著增加。(2)油红O染色显示,与对照组相比,apelin-13组小鼠主动脉窦斑块脂质蓄积明显减少;与apelin-13组相比,PTX+apelin-13组小鼠的主动脉窦处的病变脂质蓄积明显增加。(3)Masson三色染色结果显示,apelin-13组小鼠主动脉窦病变胶原纤维含量较对照组显著减少;与apelin-13对照组相比,PTX+apelin-13组小鼠的主动脉窦处的病变胶原纤维含量显著增加。(4)液体闪烁计数仪测定各组样本的3H-胆固醇放射活性。结果发现,相对于对照组,apelin-13组巨噬细胞来源的胆固醇在血清、肝脏、胆囊及粪便3H-胆固醇含量明显增多;与apelin-13组相比,PTX+apelin-13组在血清、肝脏胆囊及粪便中3H-胆固醇含量明显减少。(5)全自动生化分析仪检测显示,四组动物的体重、TG及TC均无显著差异。apelin-13组动物的血浆LDL-C水平较高脂对照组明显下降,HDL-C水平则升高;PTX+apelin-13组比apelin-13组动物的血浆LDL-C水平明显升高,HDL-C水平则下降(6)HPLC结果显示,与对照组相比,apelin-13组小鼠腹腔巨噬细胞中脂质水平明显降低;与apelin-13组相比,PTX+apelin-13组小鼠腹腔巨噬细胞中脂质水平显著升高,(7)Western blot检测自噬蛋白结果显示,与对照组相比,apelin-13组小鼠主动脉LC3蛋白表达明显升高、p62蛋白表达明显降低;与apelin-13组相比,PTX+apelin-13组小鼠主动脉LC3蛋白表达明显降低、p62蛋白表达明显升高,(8)Western blot检测I型PI3K信号通路关键蛋白结果显示,与对照组相比,apelin-13组小鼠主动脉PTEN蛋白表达明显升高、Class I PI3K蛋白表达明显降低;与apelin-13组相比,PTX+apelin-13组小鼠主动脉PTEN蛋白表达明显降低、Class I PI3K蛋白表达明显升高。并且apelin-13组小鼠主动脉Akt、m TOR磷酸化相对于对照组显著降低;PTX+apelin-13组小鼠主动脉Akt、m TOR磷酸化相对于apelin-13组显著升高。(9)Western blot法检测Class III PI3K和Beclin-1蛋白表达结果显示,与对照组相比,apelin-13组小鼠主动脉Class III PI3K和Beclin-1蛋白表达明显升高;与apelin-13组相比,PTX+apelin-13组小鼠主动脉Class III PI3K和Beclin-1蛋白表达明显降低。结论:(1)Apelin-13抑制apo E~(-/-)小鼠As病变的发生发展;(2)apelin-13抑制apo E~(-/-)小鼠As斑块内的脂质蓄积、改善血浆脂质成分和促进体内胆固醇逆向转运;(3)apelin-13可能通过自噬促进巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出延缓apo E~(-/-)小鼠血管壁As的形成。(4)apelin-13抗As的作用与PTEN/Class I PI3K/Akt和Class III PI3K/Beclin-1信号途径相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

【参考文献】