κ-阿片受体兴奋抗低氧性肺高压的作用及其机制

发布时间：2018-03-15 06:21

本文选题：低氧性肺高压　切入点：强啡肽　出处：《第四军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:低氧性肺高压(hypoxicpulmonaryhypertension,HPH)是肺高压的主要临床类型,它是临床众多心、肺疾病发生、发展过程中重要的病理生理环节,其特征主要表现为肺血管收缩和肺血管重构,但其发生机制尚不完全清楚,并且仍缺乏较为理想的治疗方法。因此,阐明HPH的发病机制和积极寻找有效的防治措施一直是医学界面临的重大课题。研究表明,缺血或低氧可促进心脏合成和释放内源性阿片肽,从而对缺血心肌产生保护作用。我们前期研究发现,缺血后处理可促进K-阿片受体(kappa-opioidreceptor,κ-OR)内源性激动剂强啡肽(Dynorphin)的释放,并起到保护缺血心肌的作用。但Dynorphin对HPH的作用尚不清楚。另外,κ-OR外源性激动剂U50,488H可通过兴奋κ-OR舒张肺动脉、抑制肺血管重构从而起到抗HPH的作用。且前期研究表明低氧可上调κ-OR的表达,其潜在机制是否由于低氧促进κ-OR内源性激动剂Dynorphin的释放?及其在HPH中的作用及机制等问题尚不清楚。近年来研究发现,钙敏感受体(calciumsensingreceptor,CaSR)在HPH形成过程中发挥了重要作用,可能会成为防治HPH的重要靶点。研究表明,肺动脉平滑肌细胞(pulmonaryarterysmoothmusclecells,PASMCs)可表达CaSR,低氧可促进其表达,后者通过信号传导介导了肺血管收缩与PASMCs增殖重构,最终导致HPH的发生。本室前期实验表明兴奋κ-OR可显著抑制低氧诱导的肺血管重构和PASMCs的增殖,从而缓解HPH的形成,同时预实验意外发现,κ-OR对CaSR蛋白具有负性调节作用。但兴奋κ-OR抗HPH的作用是否通过抑制CaSR信号实现的尚不清楚。另外,在低氧诱导的肺血管收缩反应、肺血管重构的过程中,往往伴随着炎症反应。我们前期的研究证实了兴奋κ-OR可以显著抑制心肌缺血导致的炎症反应,但是兴奋κ-OR是否可以抑制低氧诱导的肺动脉的炎症反应也未见报道。基于以上存在问题,本论文拟在前期研究结果的基础上,进一步研究(1)κ-OR内源性激动剂DynorphinA在抗HPH中的作用;(2)兴奋κ-OR是否可通过调节CaSR的作用进而发挥抗HPH的作用;(3)初步探讨κ-OR兴奋在低氧诱导的肺动脉炎症反应中的作用。通过以上研究以期深入阐明κ-OR介导的抗HPH的作用及其机制,并为临床应用阿片类药物防治HPH提供新的实验依据。目的:1.探讨κ-OR内源性激动剂Dynorphin在HPH中的作用。2.探讨κ-OR对CaSR的调节作用以及CaSR在κ-OR兴奋抗HPH中的作用。3.探讨κ-OR兴奋在低氧诱导的炎症反应中的作用。方法:1.将SD雄性大鼠置于低氧舱中模拟高原约5500m高度的气压环境,大气压约50kPa,氧浓度约10%,每日进行8h低氧处理,分别进行低氧1、2和4周。在整体水平,观察κ-OR激动剂DynorphinA、U50,488H和κ-OR阻断剂nor-BNI对HPH大鼠的平均肺动脉压力(meanpulmonaryarterialpressure,mPAP)的影响,检测CaSR激动剂新霉素和CaSR阻断剂NPS2143对HPH的血流动力学的影响。2.ELISA试剂盒检测HPH大鼠血和肺组织中DynorphinA、ET-1和AngⅡ等因子水平的变化。3.血管张力测定实验检测DynorphinAl-13、U50,488H和nor-BNI对HPH大鼠的肺动脉张力的影响,检测CaSR激动剂Spermine和NPS2143对HPH的肺动脉张力的影响。检测U50,488H和NPS2143预先处理后的低氧组大鼠肺动脉对ACh的反应。4.MTT试剂盒和BrdU试剂盒检测DynorphinA1-13对低氧诱导的PASMCs增殖的作用,采用CCK-8试剂盒检测Spermine对常氧和低氧时PASMCs增殖的影响。5.免疫荧光组织化学法检测κ-OR与CaSR在低氧时PASMCs的表达变化及定位情况。6.免疫共沉淀法检测κ-OR与CaSR在PASMCs的相互作用关系。7.Western-blot法检测U50,488H对HPH大鼠肺动脉CaSR的蛋白表达的影响;检测Spermine对正常和低氧时PASMCs的增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)、Erk和p-Erk等蛋白表达的影响。8.透射电镜检测U50,488H和NPS2143对HPH大鼠的肺血管内皮和右心室的超微结构的影响。9.液相微珠悬浮芯片检测血清细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1,MCP-1)等含量的测定结果:第一部分κ-OR内源性激动剂Dynorphin在HPH中的作用1.低氧2周和4周可显著升高雄性SD大鼠的mPAP和右心室内压(rightventricularpressure,RVP)并超过诊断标准,说明低氧2周即可形成稳定的HPH大鼠模型。2.低氧1周和低氧2周可促进SD大鼠血浆和肺组织中的Dynorphin水平的增加,而随着低氧时间延长至4周时,其水平已经回降;但ET-1和AngⅡ的水平在低氧1周、2周和4周均随时间的推进而不断显著增加。3.与低氧2周组相比,低氧前预先给予nor-BNI可进一步上调SD大鼠的mPAP。DynorphinA可显著降低低氧2周组和低氧4周组大鼠的mPAP,U50,488H也可显著抑制低氧4周组大鼠的mPAP,DynorphinA的作用弱于U50,488H的作用。4.在离体血管水平,DynorphinA和U50,488H均可舒张常氧组和低氧组大鼠的肺动脉,且两者的舒血管效应均可被nor-BNI所阻断,另外,DynorphinA的舒血管效应弱于U50,488H的舒血管效应。5.在细胞水平,DynorphinA可抑制低氧诱导的PASMCs的增殖效应,且这一效应可被nor-BNI所阻断。低氧可促进PASMCs内κ-OR的蛋白表达,而DynorphinA可进一步促进其表达,DynorphinA的这一效应可被nor-BNI所阻断。第二部分κ-OR对CaSR的调节作用以及CaSR在κ-OR兴奋抗HPH中的作用1.在常氧状态下,κ-OR和CaSR在PASMCs均有显著表达,并且以上两个受体存在共定位关系。低氧可上调以上两个受体的表达,并且共定位情况较常氧组相比更为明显。CaSR激动剂Spermine可上调两受体的蛋白表达,但以CaSR的表达增加更为明显,而U50,488H则在上调κ-OR的表达的同时下调CaSR的表达。IP结果提示两受体之间存在相互作用关系。2.在常氧状态下,Spermine可收缩SD大鼠的肺动脉。Spermine对HPH大鼠肺动脉的收缩效应较正常时显著增加,而且作用持续的时间也显著增长。U50,488H可显著抑制Spermine对正常和低氧组SD大鼠肺动脉的收缩效应。另外发现,p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125、Erk抑制剂Sch772984和MEK抑制剂U0126等均可显著抑制Spermine的收缩效应。常氧状态下,NPS2143预处理后,U50,488H的舒张肺动脉的效应明显降低。3.静脉给予CaSR另一激动剂新霉素可上调常氧组SD大鼠的RVP;新霉素还可显著上调低氧组大鼠的RVP且较常氧组升高的更为明显,持续时间更长。而预先给予U50,488H处理可抑制新霉素的这一作用。低氧前给予U50,488H和CaSR阻断剂NPS2143均可显著下调低氧诱导的SD大鼠的RVP和mPAP,而U50,488H的这一作用可被nor-BNI所阻断。此外,电镜结果显示,提前给予U50,488H和NPS2143均可显著改善低氧诱导的肺血管内皮结构紊乱和心脏结构紊乱。4.与常氧组相比,低氧3周组SD大鼠对内皮依赖性舒张剂ACh的反应性显著下降,而低氧前给予U50,488H和NPS2143均可显著增加肺血管对ACh的反应性。5.在细胞水平,Spermine处理24h可显著促进正常PASMCs的OD值(CCK-8测定试剂盒),而兴奋κ-OR可显著抑制Spermine的这一作用。此外,Spermine的作用还可被P38抑制制SB203580、JNK抑制制SP600125、Erk抑制制Sch772984和MEK抑制剂U0126所抑制。与常氧组相比,低氧组CCK-8的OD值显著上调,而Spermine可进一步上调该OD值,NPS2143和U50,488H均可显著降低低氧时PASMCs的OD值。6.在细胞水平,Spermine可显著促进正常PASMCs的PCNA和P-Erk的蛋白表达,提前给予U50,488H可显著抑制该作用,而U50,488H的这一作用又可被nor-BNI所阻断。此外,Spermine可进一步促进低氧时的PASMCs的PCNA和P-Erk的蛋白表达。而U50,488H及NPS2143均可显著降低低氧诱导的PASMCs的PCNA和P-Erk的蛋白表达。第三部分κ-OR兴奋在低氧诱导的炎症反应中的作用大鼠在低氧3周后,血清中炎症因子IL-6和MCP-1均可显著上调,而IL-10的表达没有显著变化,κ-OR兴奋可显著抑制低氧诱导的IL-6和MCP-1的表达,同时可显著上调IL-10的表达,以上效应均可被nor-BNI所阻断。结论:1.DynorphinA作为κ-OR内源性的激动剂,其与κ-OR外源性的激动剂U50,488H—样,通过扩张肺动脉、抑制平滑肌细胞增殖等具有抗HPH的作用。内源性Dynorphin在低氧早期1-2周分泌释放增加可能通过兴奋κ-OR发挥抗HPH发生的代偿作用。2.κ-OR和CaSR存在共定位和相互作用关系,而且κ-OR对CaSR具有负性调节作用;CaSR介导的MAPKs信号通路参与了对肺动脉的收缩作用和对平滑肌细胞增殖的作用,因而促进了HPH的发生,而κ-OR兴奋则具有抗HPH的作用,其作用机制可能是通过抑制CaSR/MAPKs信号通路实现的。3.κ-OR兴奋可显著抑制低氧诱导的炎症反应,其在κ-OR介导的抗HPH中的作用有待于进一步研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R544.1

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