白细胞介素-12通过抑制血管新生影响心梗后心脏修复的实验研究

发布时间：2018-03-17 03:17

本文选题：IL-12p35　切入点：单核细胞　出处：《首都医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景急性心肌梗死(AMI)是指由冠状动脉粥样硬化引起冠状动脉的分支堵塞,导致心肌细胞坏死的疾病。心肌梗死发生的早期,心肌细胞缺血坏死,大量炎症细胞浸润清除坏死的心肌细胞碎片,促进炎症,导致心脏的损伤;心梗后期,成纤维细胞激活,分泌的细胞外基质增加,而且未梗死区的心肌细胞代偿性肥大,血管新生增加、侧支循环建立,从而产生心脏修复的能力,而炎症可以参与到心脏的损伤和修复两个过程。心梗发生后,炎症细胞和炎症因子浸润增加,白细胞介素-12(IL-12)作为炎症因子,主要由巨噬细胞分泌,并参与多种炎症性心血管疾病。在心肌梗死的患者中,血清中IL-12的水平显著升高。但是,IL-12在心梗中发挥的具体作用和机制并不清楚。由血管内皮细胞引起的血管新生具有在心梗之后早期阶段挽救缺血的心肌的潜力,促血管新生的疗法一直被认为是治疗急性心肌梗死的一种很有前途的治疗策略。因此,对血管生成中的内皮细胞的反应和对血管内皮新的分子靶点的鉴定的全面了解在预防和治疗心肌梗死是必不可少的。IL-12可通过分泌抗血管新生因子IFN-γ和IP-10抑制肿瘤血管新生。但是,IL-12在心梗后血管新生中发挥的具体作用和机制并不清楚。我们提出假说:急性心肌梗死通过刺激心脏组织中IL-12p35的表达,调控单核细胞血管新生和炎症相关的基因的表达,参与影响心脏损伤和心脏修复的过程。急性心梗发生后,IL-12p35的缺陷将促进浸润的单核细胞促血管新生和抗炎的特性,并最终影响心脏功能和修复的病理过程。本研究以IL-12p35基因敲除小鼠为研究对象,关注急性心肌梗死触发心脏损伤和修复,探讨单核细胞浸润特性改变这一核心环节,为探明心梗导致心脏损伤和修复的病理机制提供实验和理论依据。目的利用野生型和IL-12p35基因敲除型小鼠复制急性心肌梗死模型,探讨小鼠心梗后心脏损伤和修复的机制。我们探讨了心梗过程中炎症因子IL-12p35的表达情况;利用IL-12p35基因型敲除小鼠和注射IL-12p35中和抗体,研究IL-12p35缺失情况下,急性心梗导致的心脏功能和心脏的重塑的保护作用;利用RNA-seq的方法,证实心梗后IL-12p35缺失的单核细胞在心梗后的炎症和血管新生中的功能;利用体内外的血管新生检测和成管实验,明确IL-12p35的抑制血管新生的作用,为寻找有效的临床干预措施提供理论和实验依据。方法1.研究对象分组:第一部分实验,实验动物雄性野生型C57/BL6小鼠40只,IL-12p35基因型敲除小鼠40只。均随机分为4组(n=20):野生型小鼠假手术组;IL-12p35基因型敲除小鼠假手术组;野生型小鼠手术组;IL-12p35基因型敲除小鼠手术组。雄性野生型C57/BL6小鼠10只,进行心梗手术之后,用流式细胞分选的方法提取心脏细胞、内皮细胞、T淋巴细胞和单核细胞。第二部分实验,实验动物雄性野生型C57/BL6小鼠40只,IL-12p35基因型敲除小鼠40只。均随机分为4组(n=20):野生型小鼠假手术组;IL-12p35基因型敲除小鼠假手术组;野生型小鼠手术组;IL-12p35基因型敲除小鼠手术组。2.小鼠急性心肌梗死模型制备:小鼠用2%异氟烷吸入麻醉,结扎冠状动脉前降支,复制小鼠急性心肌梗死模型。心梗3天后检测炎症因子IL-12p35的表达,心梗7天后检测血管新生情况,心梗4周后检测心脏功能和心脏的重塑。3.心梗后IL-12p35的表达:Real-time PCR,Western Blot蛋白免疫印记和免疫荧光法检测。4.心功能测定:使用小动物超声(Visual Sonics Vevo2100)测量模型制备前小鼠心脏功能;对心梗模型手术后小鼠测其第7天及第28天心功能。5.心脏组织纤维化测定:采用Masson三色特殊染色方法检测组织内胶原沉积。6.心肌肥厚的测定:采用麦胚凝集素(WGA)染色方法检测心肌肥厚。7.心脏组织炎症细胞浸润及炎症因子表达:免疫组织化学染色方法检测CD11b+的细胞在心脏组织中的浸润和Mac-2+的表达。8.心脏组织中血管新生的检测:利用免疫组织化学,流式细胞术和Western Blot蛋白免疫印记法检测CD31+细胞的浸润。9.下肢缺血模型制备:野生型和IL-12p35基因敲除型小鼠用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉,于上下游将股动脉分别结扎,并与两个结扎线中间剪短血管,复制下肢缺血的模型。手术前后用激光彩色多普勒检测下肢血流,若检测不到血流提示模型复制成功。下肢缺血3天,用Real-Time PCR检测炎症因子Mac-2的表达,用免疫组化染色检测CD31的表达情况。10.体外检测IL-12对单核细胞中血管新生相关因子和炎症因子的表达:提取小鼠骨髓单核细胞,培养3天后,给予重组的IL-12刺激,提取RNA,用Real-Time PCR检测单核细胞中炎症因子和血管新生相关因子的表达。11.脐静脉内皮细胞的成管实验:利用脐静脉内皮细胞的成管实验检测在缺氧的条件下,重组IL-12对内皮细胞成管的作用;利用脐静脉内皮细胞与野生型和IL-12敲除型单核细胞共培养,检测在缺氧条件下两种单核细胞对内皮细胞成管的作用,并用免疫荧光的方法染成管的内皮细胞上的v WF的表达,用激光共聚焦显微镜进行观察采图。12.内皮细胞的浸润实验:小鼠用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉,将0.5ml基质胶栓子埋入小鼠腹股沟皮下(实验组:基质胶包含未处理的野生型和敲除型单核细胞,给予或者不给于重组IL-12),7天之后取出,包埋成冰冻组织,冰冻切片进行CD31的免疫组化染色。13.统计学分析:所有数据都以平均值±标准差表示。组间均数比较采用oneway ANOVA;两组之间比较用非配对的T检验,多组之间比较用one-way ANOVA或者two-way ANOVA,P0.05认为差异有统计学意义。结果1.急性心肌梗死术后,野生小鼠心脏组织中,在RNA水平和蛋白水平IL-12p35的表达均增高;2.心梗术后的小鼠心脏组织浸润的IL-12p35主要由单核细胞分泌;3.心梗术后,与野生型小鼠组相比,IL-12p35敲除型小鼠的存活率增高;4.心梗术后,与野生型小鼠组相比,IL-12p35敲除型小鼠的心脏功能改善;5.心梗术后,与野生型小鼠组相比,IL-12p35敲除型小鼠的心脏纤维化减轻、疤痕面积减小;6.在野生型和IL-12p35敲除型小鼠心梗后流式分选出心脏组织中CD11b+细胞,提取RNA,进行RNA-sequencing(RNA测序),发现相比野生组,敲除组中差异表达的基因有1297个。用GO分析方法来分析这些差异表达的基因发现,血管新生相关和炎症相关的因子差异最大;7.检测心梗后野生型和敲除型小鼠的心脏组织中血管新生因子的表达,敲除组的促血管新生因子增加,而抑制血管新生的因子下降;8.利用流式细胞术检测心梗后野生型和敲除型小鼠的心脏组织中CD31的表达,敲除组的CD31表达增加;9.利用免疫组织化学染色方法检测心梗后野生型和敲除型小鼠的心脏组织中CD31的表达,敲除组的梗死区和交界区的CD31阳性面积增加;10.利用蛋白印迹方法检测心梗后野生型和敲除型小鼠的心脏组织中CD31的表达,敲除组的梗死区和交界区的CD31表达增加;11.利用下肢缺血的模型,验证野生型小鼠和敲除型小鼠的血管新生反应,和野生组相比,敲除组缺血后1、2和3天后,血流再灌注增加;12.提取野生型小鼠的骨髓单核细胞,体外给予IL-12刺激,与未处理组相比,IL-12组可抑制单核细胞血管新生因子表达,促进单核细胞抑制血管新生因子表达;13.利用脐静脉内皮细胞成管实验,可见,给予重组IL-12刺激,在缺氧培养的条件下并不能抑制内皮细胞在b-FGF诱导的管腔形成;14.利用脐静脉内皮细胞成管实验,在缺氧培养的条件下将野生型和敲除型骨髓单核细胞分别于内皮细胞共培养,可见,与野生型单核相比,敲除型单核细胞可以促进内皮细胞的管腔形成;而且,形成管腔的内皮细胞确实可以表达v WF这种内皮细胞的表面Marker;15.利用Matrigel plug实验,基质胶分别于野生型和敲除型小鼠的骨髓单核细胞共同埋入,可见,与野生型相比,当胶与敲除型单核细胞共埋时,CD31阳的细胞浸润到基质胶的数目增多,而给予重组IL-12后,两组的CD31阳的细胞均减少,但敲除组仍比野生组的CD31阳的细胞多;16.检测心梗后野生型和敲除型小鼠的心脏组织中炎症因子的表达,敲除组的炎症因子下降;17.提取野生型小鼠的骨髓单核细胞,体外给予IL-12刺激,与未处理组相比,IL-12组可促进单核细胞炎症因子表达;18.心梗7天后,IL-12p35敲除组小鼠与野生组小鼠相比,免疫组织化学法检测单核细胞表面的标志CD11b阳性面积和巨噬细胞标志MAC-2阳性面积明显下降;19.野生型小鼠心梗手术前、术后2、4和6天分别进行腹腔注射同型对照抗体和IL-12的中和抗体,与对照组相比,中和抗体组的心功能、疤痕面积和间质纤维化均减轻,免疫组织化学法检测内皮细胞表面标志CD31、单核细胞表面的标志CD11b和巨噬细胞表面标志Mac-2的阳性面积明显下降;结论1.在急性心肌梗死的模型中,IL-12p35表达上调,并且IL-12是浸润到心脏组织中的单核细胞所分泌的;2.在急性心肌梗死的模型中,与野生型小鼠相比,IL-12p35敲除型小鼠的心脏功能改善,心脏重塑和心肌肥厚减轻,IL-12p35参与急性心肌梗死的病理过程;3.CD11b+单核细胞的RNA转录组测序和q RT-PCR分析显示,IL-12p35基因敲除型小鼠的心脏与野生型小鼠相比,显示不同的转录特性,显示出促血管生成和抗炎的特性;4.在小鼠下肢缺血模型中,与野生型小鼠相比,IL-12p35基因敲除型小鼠的血管新生增强。此外,成管实验和基质胶的分析表明,IL-12p35的血管新生的抑制作用依赖于单核细胞;5.IL-12p35缺失通过减少趋化因子的产生和单核细胞浸润到心脏来发挥抑制炎症的作用。6.IL-12p35的中和抗体限制急性心肌梗死导致的炎症细胞浸润同时促进血管新生和心脏功能。综上所述,本研究结果表明,急性心肌梗死激活浸润到心脏中的单核细胞,表达IL-12p35增多。应用IL-12p35的敲除鼠,进一步证明了IL-12p35的缺失可以改善心梗后的心脏功能和心脏重塑及纤维化。IL-12p35敲除或者利用中和抗体中和后,心梗后的心脏中血管新生得到改善、炎症浸润减少。IL-12p35的这种保护心梗后心脏功能的作用是通过调节心梗后单核细胞的血管新生因子和炎症因子的表达。本研究首次证明急性心梗死激活浸润到心脏中的单核细胞分泌IL-12p35,进而IL-12p35抑制单核细胞分泌血管新生因子,促进单核细胞分泌促炎因子,最终通过调节心脏中的血管新生和炎症反应导致心脏功能损伤。同时还证实在心梗刺激条件下,IL-12p35参与多种血管新生和炎症相关基因的调控,为今后单核细胞分化和功能的研究提供了新的实验依据,为临床上控制和抑制急性心梗激活下心脏损伤和修复提供了崭新的视角。本研究提供新颖的体内和体外的证据,表明抑制IL-12p35的表达可能成为急性心梗导致的靶器官损伤过程中新的治疗靶点。
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【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.22

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