胰岛素上调microRNA-210抗过氧化氢致心肌细胞损伤的研究

发布时间：2018-03-20 22:18

  本文选题：胰岛素　切入点：过氧化氢　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景： 目前急性心肌梗死发病率逐年增加,已成为人类死亡率最高的疾病之一。心肌梗死过程中心肌细胞缺血缺氧会造成心肌细胞坏死和凋亡，梗死灶的中央通常以心肌坏死为主，梗死灶周边部分以细胞凋亡为主。冠状动脉血运重建治疗如支架术可以迅速开通血管，避免心肌坏死的进一步扩大，同是也伴随着心肌缺血再灌注损伤，此种心肌损伤也包括心肌细胞坏死和凋亡，心肌细胞的坏死和凋亡造成心肌细胞数量减少是引起心力衰竭发生发展的原因之一。如何减少心肌细胞在缺血缺氧条件下的凋亡成为现今心肌梗死研究的热点。寻找方法阻断诱导心肌细胞凋亡的信号或阻断将这些信号与死亡程序链接起来的通道将有助于阻遏凋亡，防止心肌细胞数量减少，以预防或改善心功能。近期文献报道microRNA-210在急性心肌梗死过程和缺血再灌注中具有抗凋亡的作用，有望成为治疗急性心肌梗死的MicroRNA，但其具体作用和机制尚未阐明。 氧化应激在心肌缺血再灌注心肌细胞坏死凋亡过程中具有重要作用。氧化应激是体内活性氧自由基产生过多，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织和细胞的损伤。自由基是过多的活性氧和活性氮自由基产生的，可以损伤脂肪、蛋白质和核苷酸。活性氧自由基、氮自由基和过氧化氢在心脏心肌缺血/再灌注中损伤中发挥着重要的作用。缺血再灌注过程中可以产生H2O2，并且在氧化应激损伤中是氧自由基的供体。H2O2在氧化应激心肌损伤中基因表达、翻译的作用机制尚未阐明，尤其是其对于microRNA的影响并不清楚。 研究表明Akt是miRNA-210的上游信号通路，胰岛素是经典的信号通路PI3K-AKT的激动剂，同时胰岛素具有抗氧化应激作用。因此我们提出科学假设：胰岛素可通过激活经典的PI3K-AKT信号通路，导致miRNA-210增加，而miRNA-210具有抗凋亡作用，进而发挥抗氧化应激、抗凋亡作用。本研究拟通过细胞学实验，通过实时定量PCR、MTT、Western Blot、流式细胞仪检测等方法验证本科学假设的正确性。 方法： 本研究应用大鼠心肌细胞系H9c2细胞，进行如下实验： （1）采用不同浓度的过氧化氢处理H9c2心肌细胞，，采用MTT方法和流式细胞仪检测方法检测心肌细胞生存率和凋亡率； （2）应用胰岛素预处理H9c2心肌细胞，然后应用过氧化氢处理，采用MTT方法和流式细胞仪检测方法检测心肌细胞生存率和凋亡率； （3）采用不同浓度的过氧化氢处理H9c2心肌细胞，实时定量PCR方法检测miRNA-210表达相对量；采用同浓度的过氧化氢处理H9c2心肌细胞不同时间，实时定量PCR方法检测miRNA-210表达相对量； （4）应用不同浓度的胰岛素处理H9c2心肌细胞，实时定量PCR方法检测miRNA-210表达相对量；采用同浓度的胰岛素处理H9c2心肌细胞不同时间，实时定量PCR方法检测miRNA-210表达相对量； （5）采用胰岛素预处理H9c2心肌细胞，采用同浓度的过氧化氢处理H9c2心肌细胞不同的时间，然后采用实时定量PCR方法检测miRNA-210表达相对量； （6）采用慢病毒载体构建miRNA-210过表达和低表达H9c2细胞模型； （7）应用过氧化氢处理miRNA-210过表达和低表达H9c2心肌细胞，流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率； （8）应用胰岛素处理miRNA-210低表达的H9c2心肌细胞，然后应用过氧化氢处理，流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率； （9）采用Western Blot法检测胰岛素和/或过氧化氢处理心肌细胞磷酸化Akt/总Akt表达比率； （10）应用PI3K/Akt阻断剂LY294002预处理H9c2心肌细胞，然后应用胰岛素和/或过氧化氢处理，实时定量PCR检测miRNA-210相对表达量。 结果： 1、过氧化氢可随浓度增加引起H9c2细胞凋亡增加； 2、胰岛素具有对抗过氧化氢所致H9c2细胞凋亡的保护作用； 3、过氧化氢、胰岛素及胰岛素+过氧化氢均可以引起miRNA-210表达增加； 4、miRNA-210过表达具有对抗过氧化氢致心肌凋亡保护作用；miRNA-210低表达可以降低胰岛素的心肌保护作用； 5、应用LY294002阻断PI3K-Akt信号通路，可以使胰岛素、过氧化氢及胰岛素+过氧化氢引起的miRNA-210表达降低。 结论： 胰岛素可通过PI3K/Akt信号通路上调miRNA-210发挥抗过氧化氢致H9c2细胞凋亡作用，本研究为胰岛素抗氧化应激的作用机制提供证据。
[Abstract]:Background:
The incidence of acute myocardial infarction increased year by year, has become one of the highest mortality rate of human diseases. The process of myocardial infarction caused by hypoxia ischemia myocytes necrosis and apoptosis of myocardial infarction, the central is generally based on myocardial necrosis, the infarct peripheral part mainly apoptosis. Coronary artery revascularization treatment such as stenting can the rapid opening of blood vessels, to avoid further expansion of myocardial necrosis, the same is also accompanied by myocardial ischemia reperfusion injury, myocardial injury that also includes myocardial cell necrosis and apoptosis, necrosis and apoptosis of myocardial cells caused by the reduction of the number of myocardial cells is one of the reasons for the occurrence and development of heart failure. How to reduce myocardial cell apoptosis in ischemic and hypoxic conditions become a hot topic of today's research method for myocardial infarction. Myocardial cell apoptosis induced by blocking the signal or the signal blocking And death program link channel will help to prevent the repression of apoptosis, decrease of myocardial cell, to prevent or improve heart function. Recently reported that microRNA-210 has anti apoptotic role in acute myocardial infarction and ischemia reperfusion in the treatment of acute myocardial infarction, is expected to become MicroRNA, but its specific mechanism has not been elucidated.
Oxidative stress plays an important role in myocardial ischemia reperfusion myocardial cell apoptosis process. Oxidative stress is the oxygen free radical in vivo activity produces too much oxidation and antioxidant system imbalance, resulting in tissue and cell injury. Free radicals are excessive reactive oxygen and active nitrogen generation of free radicals, can damage the fat, protein and nucleotide. Oxygen free radicals, nitrogen free radicals and hydrogen peroxide in myocardial ischemia / reperfusion injury in the heart plays an important role. H2O2 can produce ischemia reperfusion process, and is the donor of.H2O2 oxygen free radical gene expression in myocardial oxidative stress injury in oxidative stress injury, effect the translation mechanism has not been elucidated, especially the effect of microRNA is not clear.
Research shows that Akt is the upstream signal pathway of miRNA-210, insulin signaling pathway is a classic PI3K-AKT agonist, while insulin has anti oxidative stress. So we put forward the scientific hypothesis that insulin can activate the PI3K-AKT signaling pathway classic, lead to an increase in miRNA-210, while the miRNA-210 has anti apoptotic effects, and then play against oxidative stress, anti apoptosis. This study by cytology experiment by real-time quantitative PCR, MTT, Western Blot, the accuracy of hypothesis of flow cytometry and other methods to verify the science.
Method锛

本文编号：1641031