溶血磷脂酸对大鼠心室肌细胞L-型钙电流的影响及其信号通路研究

发布时间：2018-03-21 08:09

本文选题：溶血磷脂酸　切入点：氧化损伤　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：心血管疾病严重危害人类健康，其发病率和死亡率极高，全世界每年死于此类疾病的患者高达1900万，居各种致死性疾病的首位。心肌梗死（Myocardialinfarction，MI）是心血管疾病患者死亡的主要原因之一，动脉搭桥术、溶栓治疗和经皮冠状动脉介入治疗术（PCI）的广泛应用，显著改善了MI病人的愈后。然而部分心肌梗死患者在恢复血流灌注后，心肌功能不仅没有恢复，反而进一步恶化，发生心肌缺血再灌注（Myocardial ischemia/reperfusion，I/R）损伤。大量研究表明，活性氧(reactive oxygen species，ROS）参与了心肌的病理损伤过程，在心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤和心肌肥厚等一系列心功能障碍疾病中发挥重要作用。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧簇，是氧分子的不完全代谢产物。正常生理情况下，机体内的氧化与抗氧化过程处于动态平衡中，但是当细胞或组织缺血缺氧时，ROS清除系统功能降低或丧失，而其生成系统功能增强，使机体内氧化物的生成超过氧化物的清除，从而导致氧化系统和抗氧化系统的失衡，机体发生氧化损伤。H2O2是活性氧的一种，能够自由通过细胞膜进入细胞内，被广泛应用于模拟氧化损伤模型的制备。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）是目前已知结构最简单的甘油磷脂，普遍存在于哺乳动物的体液当中，由激活的血小板释放，能够作用于G蛋白耦联受体，在体内信号转导过程中发挥重要作用。近年来，脂类代谢产物的蓄积与缺血性心血管疾病的关系受到人们越来越多的关注。大量的临床实验证实，许多缺血性心血管疾病的发生均伴随有LPA浓度的增加，并且LPA的浓度与心血管疾病的严重程度及愈后关系密切。目前已有大量研究表明LPA在心肌梗死、动脉粥样硬化和心肌肥大等心血管系统疾病中发挥重要作用。心肌梗死后LPA浓度大幅增加，LPA参与急性心肌梗死后早期心肌细胞凋亡和晚期心肌重塑过程。本课题组前期的研究也发现，LPA能够增加心肌梗死后心律失常的发生率。有报道指出，LPA对心肌不同部位细胞的电生理作用不同，这也提示我们LPA对心肌梗死后损伤和正常部位的心肌细胞也可能发挥不同作用。本课题组的前期工作观察到LPA能够增大急性分离的豚鼠心肌细胞的钙电流，延长豚鼠乳头肌动作电位时程，但是LPA对氧化损伤后心肌细胞电生理特性的影响尚未做进一步研究，并且目前尚未见相关报道。本研究以原代培养的大鼠乳鼠心室肌细胞为研究对象，探讨LPA对原代培养的正常及氧化损伤的心室肌细胞动作电位时程和L-型钙电流的影响，并探讨其可能的分子机制，为阐明缺血性心血管疾病的发病机理提供新的理论依据。本研究主要进行以下几方面的工作： 1. LPA对心室肌细胞动作电位时程的影响采用全细胞膜片钳方法检测LPA对原代乳鼠心室肌细胞动作电位时程（APD）的影响，结果显示LPA（5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L）能够延长心室肌细胞的APD，并且随着作用时间的延长，作用效果逐渐增强。氧化损伤后心室肌细胞的APD缩短；LPA作用于氧化损伤心室肌细胞2h和4h后，心室肌细胞的APD均有不同程度的延长，而LPA作用8h和24h后，APD反而缩短。 2. LPA对心室肌细胞L-型钙电流的影响采用全细胞膜片钳和细胞贴附式膜片钳方法检测LPA对原代乳鼠心室肌细胞L-型钙电流（ICa-L）的影响，结果显示LPA能够增大心室肌细胞的ICa-L，并增加单通道的开放概率。氧化损伤后心室肌细胞的ICa-L减小，但是单通道的开放概率无明显变化。LPA作用于氧化损伤心室肌细胞2h和4h后，心室肌细胞的ICa-L增加，而LPA作用8h和24h后，ICa-L反而减小。LPA能够增大氧化损伤心室肌细胞钙通道的单通道开放概率。 3. LPA对心室肌细胞CaV1.2mRNA表达的影响采用实时荧光定量PCR的方法在基因水平上检测LPA对原代心室肌细胞编码L-型钙通道α1c亚基的基因表达的影响。结果显示，10μmol/L的LPA对心室肌细胞CaV1.2mRNA的表达无显著影响；氧化损伤后心室肌细胞CaV1.2mRNA的表达降低；LPA作用于氧化损伤心室肌细胞2h后，CaV1.2mRNA的表达无显著变化，LPA作用4h后，CaV1.2mRNA的表达减少，8h和24h后CaV1.2mRNA进一步减少。 4. LPA对心室肌细胞CaV1.2蛋白表达的影响采用Western blot方法在蛋白水平上检测LPA对编码心室肌细胞L-型钙通道α1c亚基蛋白表达的影响。结果显示，LPA对心室肌细胞CaV1.2蛋白的表达无显著影响；氧化损伤后心室肌细胞CaV1.2蛋白的表达降低；LPA作用于氧化损伤心室肌细胞2h和4h后，CaV1.2蛋白的表达无显著变化，LPA作用8h后，CaV1.2蛋白的表达减少，24h后进一步减少。 5. LPA对心室肌细胞CaN活性的影响采用分光光度计测吸光值的方法检测LPA对心室肌细胞CaN活性的影响。结果显示，LPA对原代心室肌细胞的CaN活性无显著影响，氧化损伤后CaN活性增强，LPA能够进一步增加氧化损伤心室肌细胞的CaN活性。 6. LPA对心室肌细胞NFAT核转位的影响采用细胞荧光染色的方法检测LPA对心室肌细胞NFAT核转位的影响。结果显示，，LPA对原代心室肌细胞的NFAT核转位无影响，氧化损伤后NFAT向细胞核内转移，LPA能够进一步促进氧化损伤心室肌细胞的NFAT核转位。 7. FK-506对LPA引起的心室肌细胞动作电位时程(APD)和L-型钙电流(ICa-L)变化的抑制作用采用全细胞膜片钳、实时荧光定量PCR和Western blot方法检测了CaN特异性阻断剂FK-506对LPA处理的心室肌细胞APD、ICa-L、CaV1.2mRNA和蛋白的影响。对于氧化损伤的心室肌细胞，FK-506能够抑制LPA引起的APD、ICa-L、CaV1.2mRNA和蛋白的减小。本研究首次探讨了LPA对原代培养的正常及氧化损伤心室肌细胞的不同作用。LPA通过增大原代培养的心室肌细胞L-型钙通道的单通道开放概率，使L-型钙电流增大，动作电位时程延长；氧化损伤后，细胞内Ca2+浓度大量增加，激活了CaN-NFAT信号通路，下调L-型钙通道蛋白的表达，使L-型钙电流减小，LPA进一步增加CaN-NFAT信号通路的活性，减小L-型钙电流。LPA能够增大氧化损伤心室肌细胞钙通道的单通道开放概率，使L-型钙电流增大，但是随着作用时间的延长，CaN-NFAT信号通路对L-型钙通道蛋白的调节发挥了主要作用，故LPA最终减小氧化损伤心室肌细胞的L-型钙电流和动作电位时程。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54

【参考文献】