丝裂原活化蛋白激酶、钙蛋白酶和膜联蛋白A5在醛固酮诱导原代心肌细胞凋亡中的分子机制及相关临床研究

发布时间：2018-03-21 16:55

本文选题：醛固酮　切入点：心肌细胞　出处：《贵州医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:1.研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、钙蛋白酶(calpain)和膜联蛋白A5(ANXA5)信号转导系统在醛固酮(ALD)诱导心肌细胞凋亡过程中的作用,了解calpain、ANXA5、MAPKs之间的调控关系,阐明ALD诱导心肌细胞凋亡的关键作用机制。2.观察氧化苦参碱(OMT)减轻ALD诱导心肌细胞损伤这一保护作用中MAPKs、calpain和ANXA5表达的变化,进一步阐释ALD诱导心肌细胞损伤的分子机制,寻找防治心肌细胞凋亡的有效作用靶点。3.阐明ANXA5基因多态性与原发性高血压左心室肥厚易感性的关系,为左心室肥厚的分子机制提供新的线索。方法:1.采用0.06%胰酶消化、差速贴壁法分离纯化1-3d SD新生大鼠心肌细胞做原代培养。用倒置显微镜观察细胞形态学改变,心肌细胞特异性肌钙蛋白免疫细胞化学鉴定心肌细胞及其纯度。MTT探索ALD损伤心肌细胞的最佳作用浓度及作用时间。建立ALD诱导心肌细胞凋亡模型,并用MTT法和流式细胞仪验证。基因芯片检查MAPKs、calpain、ANXA5基因表达,Real-time PCR、Western-blotting法检测calpain1、calpain2、p38、JNK、ERK、ANXA5、p-caspase3的m RNA和蛋白表达水平。实验分对照组、ALD组、ALD+anti-calpain1组、ALD+anti-calpain2组、ALD+anti-P38组、ALD+anti-ERK组、ALD+anti-JNK组。对各组细胞采用Real-time PCR和Western-blotting法检测calpain1、calpain2、p38、JNK、ERK m RNA和蛋白表达水平。抗ANXA5干预ALD诱导的心肌后,Western-blotting法检测calpain1、calpain2、p38表达。2.原代心肌细胞用氧化苦参碱(OMT)干预,分为对照组、ALD组、ALD+L-OMT组(L低剂量,OMT浓度25μg/ml)、ALD+H-OMT组(H高剂量,OMT浓度50μg/ml)、ALD+阿司匹林组和ALD+螺内酯组。各组细胞采用MTT法检测细胞凋亡,LDH检测细胞毒性,Giemsa染色和HE染色观察细胞形态,Real-time PCR和Western-blotting法检测calpain1、calpain2和p38、ANXA5m RNA和蛋白表达水平。3.研究对象为贵州省贵州医科大学附属医院原发性高血压患者,共850例。其中包括337例原发性高血压伴左心室肥厚患者,513例原发性高血压非左心室肥厚患者。所有入选者均进行心脏超声的检测并采集外周静脉血。SNa Pshot法检测实验对象外周静脉血中ANXA5基因多态性,观察高血压人群外周静脉血中ANXA5基因多态性与原发性高血压并发左室肥厚发病率之间的关系。结果:1.胰酶消化法成功分离培养原代心肌细胞并经肌钙蛋白免疫细胞化学鉴定显示心肌细胞阳性率达95%以上。用MTT检测确定ALD最佳浓度为10-5mol/L,最佳作用时间为48小时,此条件下ALD诱导心肌细胞凋亡率达37.8%。10-5mol/L浓度下ALD作用48h后心肌细胞的基因表达结果:较对照组比较ANXA5增高9.63倍,p38增高4.05倍,calpain1、calpain2增高3.31倍和2.16倍,JNK、ERK1/2增高1.43和1.62倍。10-5mol/L浓度下ALD作用48h后心肌细胞中calpain1、calpain2、p38、p-p38、ANXA5、p-caspase3蛋白表达增加,m RNA表达增加(p0.05),JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达增加不明显,m RNA表达增高但差异无统计学差异(p0.05)。anti-calpain1干预ALD诱导的心肌细胞后,calpain1、calpain2和p38 m RNA水平显著降低(p0.05),表明calpain1的蛋白及m RNA表达对calpain2、p38蛋白及m RNA表达有影响,对ERK1/2、JNK蛋白及m RNA表达没有影响;anti-calpain2干预后,calpain2和p38 m RNA水平显著降低(p0.05),表明calpain2的蛋白及m RNA表达对p38蛋白及m RNA表达有影响,对calpain1、ERK1/2、JNK蛋白及m RNA表达没有影响;anti-p38、anti-JNK,anti-ERK干预后,分别有p38、JNK、ERK1/2 m RNA水平显著降低(p0.05),表明p38、JNK、ERK1/2的蛋白及m RNA表达对calpain1、calpain2蛋白及m RNA表达没有影响,这三者之间也没有相互影响。anti-calpain1,anti-calpain2,anti-JNK,anti-ERK,anti-p38干预ALD诱导的心肌细胞后,ant-calpain1、ant-calpain2、ant-p38组心肌细凋亡率较ALD组显著降低(p0.05),但仍高于对照组(p0.05),表明与ALD诱导的心肌细胞凋亡有关的是calpain1、calpain2和p38。ANXA5抑制剂干预ALD诱导的心肌细胞中,较ALD组比较calpain1、calpain2蛋白及m RNA表达无明显改变,p38蛋白表达量降低,p38m RNA表达明显减低(p0.001),表明ANXA5蛋白及m RNA表达对p38的蛋白和m RNA表达有影响,对calpain1、calpain2的蛋白及m RNA表达没有影响。2.MTT实验表明ALD组细胞存活率值显著低于对照组(p0.05);ALD+L-OMT组(25μg/ml)和ALD+H-OMT组(50μg/ml)ALD+阿司匹林组和ALD+螺内酯组细胞存活率显著高于ALD组(p0.05)。LDH外漏实验结果提示,ALD组LDH外漏率显著高于对照组(p0.05);ALD+L-OMT组和ALD+H-OMT组、ALD+阿司匹林组和ALD+螺内酯组LDH外漏率值均显著低于ALD组(p0.05)。心肌细胞经Giemsa染色后,细胞核被染为蓝紫红色,细胞浆染成淡红色。正常组的细胞核稍偏、大小适宜呈正常结构;ALD组的细胞肥大、胞核居中;与ALD组比较,ALD+L-OMT组、ALD+H-OMT组、ALD+阿司匹林组和ALD+螺内酯组细胞表面积减小,形态接近于正常。Western-blotting及Real-time PCR结果显示与ALD组比较,ALD+L-OMT组和ALD+H-OMT组、ALD+阿司匹林组和ALD+螺内酯组与ALD组calpain1,calpain2和p38、ANXA5蛋白表达减低,m RNA表达减低(p0.05)。3.左室肥厚患者中ANXA5SNPs表达是一项重要的危险因素,ANXA5SNPrs1050606与高血压左心室肥厚患病易感性有统计学差异(显性患者:p=0.008;共显性患者p=0.006)。此外,也研究也证明在原发性高血压左室左室肥厚患者中,ANXA5的M1,M2单体也被证明是危险因素(p=0.022和0.032)。结论:1.ALD可以通过上调calpain1、calpain2、ANXA5和p38表达水平,激活caspase3来诱导心肌细胞凋亡。calpain、ANXA5与MAPKs之间存在调控关系,机制可能为calpain1、2通过调控ANXA5来影响p38表达,进而影响心肌细胞凋亡。2.OMT可以通过下调calpain1、calpain2、ANXA5和p38的表达水平来减轻心肌细胞凋亡。calpain1、calpain2、ANXA5和p38可以作为减轻ALD诱导的心肌凋亡、改善高血压心肌重构、延缓心衰进程的关键作用靶点。3.ANXA5rs1050606,M1和M2单倍体与贵州原发性高血压人群的左心室肥厚显著相关。
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【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

【参考文献】