心脏震波诱导SD大鼠梗死周围心肌冠脉微血管动脉生成及其分子机制研究

发布时间：2018-03-24 21:11

本文选题：体外心脏震波　切入点：动脉生成　出处：《昆明医科大学》2016年博士论文

【摘要】：[背景]缺血性心脏病(IHD)严重危害全球公众健康。建立冠脉侧支循环、改善心肌微循环是减轻心肌缺血的关键环节,但目前临床缺乏有效干预手段。我们的前期研究发现,体外心脏震波疗法(CSWT)从体表导入低能量震波脉冲,可在心肌组织中形成空穴效应,对组织和细胞产生剪切力作用,促进内皮细胞多种生长因子表达上调,诱导缺血心肌局部血管新生；同时,CSWT可改善IHD患者的心肌灌注和心肌代谢,能改善模型动物的冠脉侧支循环。然而,单纯的血管新生对恢复缺血组织有效血液灌注的作用有限。当冠脉微血管通过动脉生成进行管腔改建,形成有功能的侧支循环,才能有效改善缺血心肌的组织灌注。目前,CSWT能否诱导冠脉微血管动脉生成、促进有效侧支循环建立及其相关的分子机制并未明确。[目的]对SD大鼠急性心肌梗死模型实施经胸震波干预,探讨CSWT剪切力对梗死周围心肌冠脉微血管的动脉生成有无诱导作用及其可能的分子机制,为深入了解CSWT的显效机制、探索冠心病治疗新策略和新方法提供科学依据。[方法]①随机入选55只成年雄性SD大鼠,手术开胸、高位结扎左冠状动脉前降支,建立SD大鼠急性心肌梗死模型。术前及术后采用高频超声心动图评价大鼠心功能,TTC染色测定心肌缺血面积,评价建模成功率和平行性。②另入选70只成年雄性SD大鼠,随机分为假手术组(Sham组10例)、心肌梗死组(AMI组30例)和心脏震波干预组(CSWT组30例)。AMI组和CSWT组先建立急性心肌梗死模型。Sham组除不结扎冠脉外,其余操作同另两组。真假手术后,所有大鼠均常规饲喂。CSWT组实施心脏震波干预：震波能量0.24mJ/mm2,每次200脉冲,频率60次/min每周3天,每天1次,共4周。③CSWT干预4周后,采用高频超声心动图评价大鼠心功能；摘取左室心肌行组织切片免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察冠脉微血管动脉生成情况；TUNEL及Western blotting方法观察心肌细胞凋亡和凋亡相关蛋白表达量变化；MASSON染色观察心肌纤维化程度。④采用Label free蛋白质非标记定量技术分析CSWT组和平行对照AMI组SD大鼠在CSWT干预后第1、2、4周时心肌组织中的蛋白表达量差异。应用生物信息学分析方法对差异表达蛋白进行GO功能注释、KEGG通路注释及富集分析,找出差异表达蛋白质显著富集的GO和KEGG条目。分析筛选CSWT诱导AMI大鼠冠脉微血管动脉生成这一生物力学过程中,核心的调控信号通路和相关目的蛋白,并采用Western blot方法验证相关目的蛋白在大鼠心肌组织中的表达量。[结果]①55只SD大鼠均完成AMI模型制作,手术成功率为100%。术后1周存活率90.9%。术后高频超声心动图示AMI大鼠心室间隔运动幅度明显减弱或无运动、心尖部膨隆；LVESD(3.09+0.40与5.77+0.48,P0.01)和LVEDD(4.92±0.37与8.06+0.47,P0.01)较术前明显增大,FS明显降低(37.07±8.01与28.37±6.79,P0.01)。离体后,肉眼可见大鼠心脏左室壁变薄、局部塌陷、表面颜色灰暗。TTC染色后测算梗死心肌面积占左室面积的百分比为35.66%±3.77%。② CSWT干预AMI大鼠第4周,高频超声心动图示：CSWT组大鼠LVESD和LVEDD较AMI组明显改善(4.32±0.20与5.71±0.33和6.43±0.32与7.73+0.55,P0.01),FS也有提高(32.54±5.43与25.80±7.34,P0.05)。③免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察到CSWT组大鼠梗死周围心肌的微动脉(100μm)管径较AMI组扩大,动脉管壁平滑肌层厚度明显增加；冠脉微动脉平滑肌细胞内G-actin荧光强度明显高于AMI组。④Western blot检测示,抗凋亡蛋白Bcl-2在CSWT组(1.08±0.03)和Sham组(1.02+0.02)中的相对表达量明显高于AMI组(0.10±0.02)(P均0.01)。促凋亡蛋白Bax和Caspase-3在CSWT组的相对表达量(0.65+0.05和0.00+0.02)明显低于AMI组(1.10±0.10和1.31±0.12),P均0.01。CSWT组心肌凋亡指数明显低于AMI组(29.91±2.96与15.42±1.33)%(P0.05)⑤Masson三色染色示,AMI组梗死周围心肌的纤维化程度较Sham组和CSWT组明显,心肌纤维排列紊乱,胶原沉积较多。CSWT组心室肌间质胶原容积分数(18.70±13.06)%高于Sham组(0.31±0.17)%,但低于AMI组(70.70+12.34)%(P均0.05)。⑥采用Label free蛋白质非标记定量技术方法在CSWT组和AMI组大鼠心肌组织中共鉴定出1320个蛋白质。两组间蛋白质差异表达分析显示,相对于AMI组,CSWT干预1周后,有50个蛋白质的表达明显上调,29个蛋白质的表达明显下调；第2周后,有60个蛋白质的表达明显上调,22个蛋白质的表达明显下调；第4周后,有65个蛋白质的表达明显上调,24个蛋白质的表达明显下调。生物信息学分析提示,差异表达蛋白在黏着斑(focal adhesion)信号通路显著富集。该信号通路中,整合素连接激酶(ILK)、胶原蛋白Ⅵα3(Col6a3)、层粘连蛋白a5 (Lama5)、钙激活的中性蛋白酶2(Capn2)蛋白的表达随CSWT干预时间增加呈逐渐上调的趋势；Ras相关蛋白1b (Raplb)、玻璃粘连蛋白(Vtn)、整合素β3 (Itgb3)、α辅肌动蛋白(Actn1)、肌球蛋白轻链7(Myl7)蛋白的表达则呈逐渐下调的趋势。其中,ILK、Col6a3、Capn2、 Vtn、Itgb3和Actn1共6个蛋白的表达经Western blot验证,其时序表达变化趋势与Lable free结果一致。⑦伴随CSWT干预的实施,AMI大鼠心肌组织中整合素连接激酶ILK的蛋白表达量呈持续增加的趋势,与CSWT干预后AMI大鼠冠脉微血管动脉生成的表型密切关联。[结论]①开胸高位结扎左冠状动脉前降支可成功建立稳定、平行性良好的SD大鼠AMI模型,是心血管领域蛋白组学和基因组学研究的理想动物模型。② CSWT干预可诱导大鼠梗死周围心肌内冠脉微血管动脉生成,使微血管壁肌层增厚、管腔扩大、平滑肌细胞去分化和增殖,从而改善冠脉侧支循环、抑制心肌细胞凋亡和纤维化、减缓左室重构、改善AMI大鼠心功能。③CSWT剪切力的机械信号作用于AMI大鼠心肌组织并转化为生物学效应的过程中,黏着斑信号通路在相关的信号网络调控中可能具有核心地位。④整合素连接激酶等时序差异表达蛋白与CSWT干预后AMI大鼠冠脉微血管的动脉生成表型密切关联,可能是CSWT剪切力在冠脉微血管产生一系列生物力学效应的关键因子,有望成为CSWT生物力学机制研究的新切入点,为探索CSWT促冠脉微血管动脉生成的分子机制提供新思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.22

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