机械牵张力和oxLDL叠加促进巨噬细胞MAPK活化及细胞的增殖与凋亡
发布时间：2018-03-29 13:56
本文选题：机械牵张力 切入点：氧化低密度脂蛋白 出处：《中山大学》2016年博士论文
【摘要】：目的高血压或者高血脂最终归属均为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),若两者同时存在时,血管粥样硬化发展更快,其致病机制不十分明了。粥样硬化斑块中泡沫细胞来源主要有血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)和巨噬细胞,在高血压血管病变中对VSMC已有较多研究,对巨噬细胞研究报道却很少。本课题通过研究氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)、机械牵张力(stretch stress,SS)单独或共同存在时对巨噬细胞丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、氧化应激反应及细胞的增殖与凋亡以及DNA甲基化的影响,从全新的角度阐述高血压合并高血脂协同促进血管重塑的致病机制。实验方法1.用高速离心法分离血浆脂蛋白LDL(native LDL,nLDL),加硫酸铜对其进行氧化获得oxLDL;用油红染色和MTT法鉴定nLDL和oxLDL。2.Western blot检测nLDL、oxLDL和/或机械力作用RAW264.7细胞后,细胞内的MAPKs磷酸化水平的改变。3.辛伐他汀(Simvastatin,SIM)预处理RAW264.7细胞,Western blot检测其 对oxLDL和/或机械牵张力引起的细胞MAPKs磷酸化的影响。4.辛伐他汀、oxLDL和机械牵张力共同作用于RAW264.7细胞,用免疫荧光法检测细胞增殖(Ki-67)及凋亡(TUNEL)情况。5.应用辛伐他汀预处理RAW264.7细胞,用免疫荧光的方法检测oxLDL和/或机械牵张力引起的细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生情况。6.应用NADPH氧化酶抑制剂(罗布麻宁)预处理细胞,用免疫荧光的方法检测oxLDL和/或机械牵张力引起的细胞ROS的产生情况。7.体外分离C57BL/6J小鼠主动脉中膜,用组织块贴壁法原代培养VSMCs,并用普通光镜、Western Blot和免疫荧光的方法进行形态学与生物化学鉴定。8.辛伐他汀、oxLDL和机械牵张力共同作用于RAW264.7细胞,用免疫荧光法检测细胞全基因甲基化水平的改变。结果:1.离心后,nLDL与血浆其他成分分界明显,蛋白定量检测显示nLDL浓度较高,油红染色显示oxLDL组的RAW264.7细胞内吞噬的脂滴明显比nLDL组多。MTT数据分析显示nLDL、oxLDL均可促进RAW264.7细胞增殖,且oxLDL比nLDL更明显促进细胞增殖。辛伐他丁可抑制nLDL与oxLDL诱导的细胞增殖。2.机械牵张力和oxLDL单独作用均可以诱导RAW264.7细胞MAPK激活,且呈时间(0-60min)和浓度(0-100μg/ml)依赖性。50μg/ml oxLDL比同浓度的nLDL更能显著诱导MAPK激活;当oxLDL和机械牵张力共同作用时,可使细胞MAPK进一步激活,大于任一单独因素的作用,呈叠加促进效应。3.辛伐汀预处理RAW264.7细胞后,可以抑制oxLDL和/或机械牵张力诱导的细胞MAPK的激活。4.机械牵张力和oxLDL单独作用均可以诱导RAW264.7细胞增殖和凋亡同时增加,两者同时作用时具有叠加作用。辛伐他汀可以抑制oxLDL和/或机械牵张力引起的细胞增殖和凋亡同时增加。5.机械牵张力和oxLDL单独作用均可以诱导RAW264.7细胞ROS水平升高,两者同时作用时具有叠加促进作用。应用辛伐他汀预处理细胞后,可以抑制 oxLDL和/或机械牵张力诱导的ROS产生。6.应用NADPH氧化酶抑制剂罗布麻宁预处理RAW264.7细胞后,可以抑制机械牵张力和/或oxLDL诱导的细胞的ROS产生。7.原代培养小鼠主动脉中膜组织,7天左右细胞从组织中长出。细胞呈长梭型与谷峰样外观。经生化鉴定细胞表达平滑肌特异抗原SM-α-actin。8.机械牵张力和oxLDL单独作用均可以诱导VSMCs DNA甲基化水平降低,当两者共同作用时,其甲基化水平明显低于任一单因素的作用,具有叠加促进作用,辛伐他汀可以抑制oxLDL和/或机械牵张力诱导的甲基化水平。结论:1.机械牵张力和oxLDL可分别促进RAW264.7细胞MAPKs磷酸化、ROS升高以及细胞增殖与凋亡,而两者共同作用时上述作用增强,辛伐他汀可抑制上述效应。2.NADPH氧化酶抑制剂罗布麻宁减少了机械牵张力和oxLDL作用下巨噬细胞ROS的产生。3.机械牵张力和oxLDL可单独引起VSMCs甲基化水平降低,当两者共同作用时降低更明显。辛伐他汀可抑制上述效应。4.该研究结果将进一步为高血压并发高血脂的防治研究提供重要的实验依据。
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本文编号：1681428
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