动脉粥样硬化早期管壁微血管新生的相关机制及通络干预研究

发布时间：2018-03-30 23:26

本文选题：动脉粥样硬化　切入点：血管新生　出处：《河北医科大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:本研究以脉络学说营卫“由络以通、交会生化”理论为指导,通过高脂饮食喂养联合颈动脉套管置入术的方法,建立AS早期颈动脉损伤的复合兔模型,通过观察管壁微血管新生和神经内分泌、氧化应激相关因子表达,探讨颈动脉管壁微血管新生在AS早期的作用及通络药物的干预效果,不仅为营卫“由络以通,交会生化”理论在血管病变中的应用提供研究模型与实验数据,而且有助于阐明AS“由外而内”的发病途径,对开辟AS早期的有效防治新途径具有重要意义。方法：1高脂联合颈动脉套管置入术建立AS早期管壁微血管新生模型及通络药物干预作用采用高脂饮食喂养联合颈动脉套管置入术的方法建立右颈动脉管壁微血管新生的新西兰兔模型,观察颈动脉组织病理形态学变化和动脉管壁微血管新生情况,探讨颈动脉管壁微血管新生在AS早期的作用及通络药物的干预效果。将120只普通级新西兰白兔随机分为正常组和模型组,及通心络高、中、低剂量组、阿托伐他汀组、LY294002组(PI3K/AKT抑制剂组)和PD98059组(MEK/ERK抑制剂组),共8个组,每组15只,实验周期4周。以浓度25%Pluronic#174;F-127凝胶液为载体,制做含有PI3K、MEK抑制剂的缓释凝胶,终浓度为200μmol/L。将含抑制剂的缓释凝胶经导管注入到硅胶管中,包裹于颈动脉,经血管外膜局部给药,局部用药量为每兔0.5ml 200μmol/L的缓释凝胶抑制剂。正常组全程给予普通饲料喂养,其余各组于术后次日开始给予高脂饲料喂养,每兔每日限量120 g左右,同时给予药物干预治疗。通心络高、中、低剂量组分别给予通心络超微粉0.60 g/(kg·d)、0.30 g/(kg·d)、0.15 g/(kg·d),阿托伐他汀组给予阿托伐他汀2.50 mg/(kg·d)。检测血清血脂水平,反映脂质代谢情况;HE染色观察血管病理形态学变化;Masson染色观察动脉管壁血管平滑肌的增生情况及胶原纤维生成情况;油红O染色观察腹主动脉内膜脂质沉积情况;CD31、VEGF免疫组化染色反映颈动脉管壁微血管新生的程度;彩色微球法检测管壁微血管内的血流量改变,反映微血管功能障碍的发生。2颈动脉管壁微血管新生的神经内分泌机制及通络药物干预作用本部分在第一部分模型建立成功基础上,观察兔颈动脉管壁微血管新生的神经内分泌机制及通心络干预效果。将90只普通级新西兰白兔随机分为正常组和模型组及通心络高、中、低剂量组和阿托伐他汀组,共6个组,每组15只。造模方法及药物给药量同上。检测血浆NE、Ach水平;免疫荧光技术对颈动脉管壁TH、Ach E、NGF、NPY的定位和表达;Western Blotting技术测定颈动脉组织中α1-肾上腺素能受体(α1-AR)与α7-烟碱乙酰胆碱受体(α7n Ach R)蛋白表达水平。3颈动脉管壁微血管新生的氧化应激机制及通络药物干预作用本部分进一步探讨颈动脉管壁微血管新生的氧化应激机制及通心络的干预效果。将120只普通级新西兰白兔随机分为正常组和模型组,及通心络高、中、低剂量组、阿托伐他汀组、LY294002组和PD98059组,共8个组,每组15只,实验周期4周。以浓度25%Pluronic#174;F-127凝胶液为载体,制做含有PI3K、MEK抑制剂的缓释凝胶,终浓度为200μmol/L。将含抑制剂的缓释凝胶通过导管注入到硅胶管中,包裹于颈动脉,经血管外膜局部给药,局部用药量为每兔0.5 ml 200μmol/L的缓释凝胶抑制剂。其它药物的给药量同上。实验结束,检测血清MDA、SOD、T-AOC、CAT与GSH-px生化指标;应用荧光原位杂交和逆转录PCR技术对颈动脉组织中NADPH亚单位p22phox m RNA、gp91phox m RNA进行定位和半定量检测;DHE荧光探针检测颈动脉管壁ROS生成;Western Blotting技术检测颈动脉管壁中ROS敏感的PI3K/AKT及ERK通路蛋白及血管新生相关因子VEGF-A/VEGFR-2蛋白表达水平;免疫组化技术观察颈动脉管壁CD31标记的微血管密度变化及p-AKT、p-ERK蛋白的定位表达。结果： 1高脂联合颈动脉套管置入术建立AS早期动脉管壁微血管新生模型及通络药物干预作用1.1各组动物血脂水平变化与正常组比较,模型组血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均显著升高,差异有统计学意义(P0.01);LY294002组和PD98059组TC、TG、LDL-C、HDL-C水平与模型组比较均无统计学差异(P0.05);通心络高、中剂量组和阿托伐他汀组血清TC、TG、LDL-C水平均明显低于模型组(P0.05,P0.01),通心络高剂量组和阿托伐他汀组HDL-C水平显著高于模型组(P0.01);通心络高、中剂量组与阿托伐他汀组组间比较,TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均无统计学差异(P0.05)。1.2腹主动脉油红O染色正常组腹主动脉大体观察呈乳白色,内膜平整光滑,未出现脂质沉积。模型组、LY294002组和PD98059组腹主动脉内膜出现多病灶、散在的脂质沉积,脂质成分呈红色,呈斑点或长短不一的条纹,即脂纹或脂斑形成,为AS早期病变。通心络高、中、低剂量组及阿托伐他汀组不同程度减少腹主动脉内膜的脂质沉积,以通心络高剂量组和阿托伐他汀组脂质沉积较模型组明显减少。1.3颈动脉组织Masson染色正常组颈动脉组织各层结构清晰,内膜平整光滑,中膜平滑肌细胞排列整齐。模型组血管内膜明显增厚,平滑肌细胞迁移,胶原纤维大量沉积,中膜平滑肌细胞增多,排列紊乱。通心络高、中剂量组和阿托伐他汀组、LY294002组和PD98059组较模型组内膜增生不明显,少量胶原纤维沉积,无明显平滑肌细胞迁移,中膜平滑肌细胞少量增生,排列较整齐。1.4颈动脉组织HE染色颈动脉以内、外弹力膜为界,从管腔向外依次为内膜、中膜和外膜。正常组内膜光滑,内弹力膜呈波浪状,单层内皮细胞完整连续,中膜平滑肌细胞走行清晰,外膜结缔组织,可见少量微血管、成纤维细胞和神经末梢。模型组,新生内膜形成,内弹力膜连续性中断,平滑肌细胞增殖明显,走形紊乱,部分弹力纤维断裂或消失,中膜间隙明显增宽,外膜结缔组织增生,炎细胞浸润,微血管数目增多。与模型组相比,通心络高、中、低三个剂量组和阿托伐他汀组、LY294002组和PD98059组内膜增生不同程度减轻,中膜平滑肌走形较清晰,外膜结缔组织增生较不明显,微血管数量不同程度减少,炎细胞浸润减轻。1.5颈动脉管壁CD31和VEGF免疫组化染色VEGF阳性物为棕黄色颗粒状,主要位于细胞质及细胞外间质中。正常组内膜、中膜及外膜均可见VEGF少量阳性表达。模型组血管各层VEGF阳性表达明显增多,外膜微血管内皮细胞及周边部位表达阳性,外膜部分成纤维细胞表达也呈阳性。通心络和阿托伐他汀干预后,外膜VEGF阳性表达不同程度上减少。以VEGF阳性表达率作为评判指标:模型组外膜VEGF阳性表达率显著高于正常组,差异具有统计学意义(P0.01)。与模型组比较,通心络高、中剂量组和阿托伐他汀干预后,外膜VEGF阳性表达率明显降低(P0.05,P0.01),以通心络高剂量组降低最为显著,差异具有统计学意义(P0.01),通心络高、中剂量组和阿托伐他汀组组间比较均无统计学差异(P0.05),LY294002组、PD98059组外膜VEGF阳性表达率较阿托伐他汀组差异无统计学意义(P0.05)。正常组颈动脉可见CD31标记的少量微血管,位于血管外膜。模型组外膜微血管数量明显增多,中膜未见CD31标记的微血管。与模型组相比,通心络各剂量组和阿托伐他汀组及LY294002组和PD98059组外膜微血管数量不同程度减少,以通心络高、中剂量组、阿托伐他汀组、LY294002组和PD98059组外膜微血管数量减少较为明显。管壁微血管密度定量分析显示,模型组MVD阳性标记指数较正常组显著升高,差异具有统计学意义(P0.01),通心络高、中剂量组和阿托伐他汀组MVD阳性标记指数较模型组显著降低,差异具有统计学意义(P0.01),通心络高剂量组较阿托伐他汀组MVD阳性标记指数降低明显,差异具有统计学意义(P0.05),LY294002组、PD98059组MVD阳性标记指数较阿托伐他汀组差异无统计学意义(P0.05)。1.6颈动脉管壁微血管血流量(MBF)的变化模型组颈动脉管壁血流量MBF较正常组显著升高,差异具有统计学意义(P0.01)。与模型组比较,通心络各剂量组和阿托伐他汀组MBF不同程度降低,以通心络高、中剂量组和阿托伐他汀组降低明显,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01),通心络组高剂量组MBF较阿托伐他汀组显著降低,差异具有统计学意义(P0.01),LY294002组与阿托伐他汀组比较差异明显,具有统计学意义(P0.05),PD98059组较阿托伐他汀组差异无统计学意义(P0.05)。2颈动脉管壁微血管新生的神经内分泌机制及通络药物干预作用2.1各组实验兔血浆NE、Ach水平Elisa检测实验兔血浆NE、Ach含量,结果分析显示各组血浆NE、Ach含量组间比较无统计学差异(P0.05)。2.2免疫荧光检测动脉管壁TH、Ach E的定位免疫荧光显示,在正常颈动脉内膜和中膜—外膜交界区域分布有TH标记的去甲肾上腺素能神经,Ach E标记的胆碱能神经则主要分布在中膜/外膜区域。模型组表现为中膜—外膜交界区域分布的去甲肾上腺素能神经消失,但在外膜微血管周围去甲肾上腺素能神经明显增生,在外膜区域去甲肾上腺素能神经较胆碱能神经再生明显。通心络各剂量组可不同程度抑制动脉管壁的神经重构,减少中膜—外膜交界区域分布的去甲肾上腺素能神经去支配,抑制外膜微血管周围去甲肾上腺素能神经再生。2.3免疫荧光检测动脉管壁NGF、NPY的表达NGF、NPY免疫荧光显示,正常颈动脉管壁各层基本无NGF表达,NPY表达在中膜—外膜交界区域。模型组NGF、NPY在外膜区域微血管周围表达明显增强,但NPY在中膜—外膜交界区域表达明显减少,通心络各剂量组可不同程度降低NGF、NPY在外膜区域的阳性表达,增加NPY在中膜—外膜交界区域的表达。2.4颈动脉组织α1-AR与α7n Ach R的蛋白表达正常组有少量α1-AR、α7n Ach R蛋白表达,模型组α1-AR、α7n Ach R蛋白表达明显增多,通心络高、中、低剂量组、阿托伐他汀组α1-AR、α7n Ach R蛋白表达不同程度下调。灰度分析显示,与正常组比较,模型组α1-AR、α7n Ach R显著升高,差异有统计学意义(P0.01),与模型组比较,通心络高、中剂量组、阿托伐他汀组α1-AR、α7n Ach R显著降低,差异具有统计学意义(P0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组α1-AR、α7n Ach R降低明显,差异均具有统计学意义(P0.05)。3颈动脉管壁微血管新生的氧化应激机制及通络药物干预作用3.1血清MDA、SOD、T-AOC、CAT与GSH-px水平变化与正常组比较,模型组血清SOD、CAT、T-AOC、GSH-px活性显著下降,MDA含量显著升高,差异均具有统计学意义(P0.01)。与模型组比较,通心络高、中剂量组及阿托伐他汀组血清SOD、GSH-px、CAT、T-AOC活性明显升高,MDA含量明显降低,差异均具有统计学意义(P0.05,P0.01),通心络高、中剂量组SOD、CAT、T-AOC、GSH-px活性及MDA含量与阿托伐他汀组组间比较无统计学差异(P0.05)。3.2 ROS在颈动脉管壁的分布与外膜定量比较正常组颈动脉内膜、中膜及外膜均存在低水平ROS,模型组外膜ROS生成明显增多,在微血管及邻近部位表达明显,通心络高、中剂量组和阿托伐他汀组较模型组外膜ROS生成明显减少。荧光强度定量分析显示,模型组外膜ROS水平较正常组显著增强,差异具有统计学意义(P0.01),LY294002组、PD98059组及通心络低剂量组外膜ROS水平较模型组差异无统计学意义(P0.05),通心络高、中剂量组和阿托伐他汀组外膜ROS水平较模型组显著减低,差异具有统计学意义(P0.01),与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组外膜ROS水平明显减低,差异具有统计学意义(P0.05)。3.3颈动脉管壁微血管密度MVD与外膜ROS水平的相关分析对管壁微血管密度MVD与外膜ROS水平进行Spearman相关分析,统计结果显示管壁微血管密度MVD与外膜ROS水平呈显著正相关(r=0.893,P0.01)。3.4颈动脉管壁NADPH氧化酶亚基p22phox和gp91phox的定位与定量表达原位杂交结果显示,正常组颈动脉组织p22phox基因杂交信号表达极少,仅限于血管外膜,gp91phox基因杂交信号分布在血管内膜和外膜,以外膜表达为主,在血管外膜gp91phox基因杂交信号较p22phox分布密集。模型组血管p22phox和gp91phox基因杂交信号表达呈强阳性,主要分布在新生内膜和外膜微血管及邻近部位。LY294002组、PD98059组和通心络低剂量组p22phox和gp91phox基因阳性信号分布及表达较模型组未见明显变化。通心络高、中剂量组和阿托伐他汀组p22phox和gp91phox阳性杂交信号在外膜表达不同程度减弱。为了评估ROS来源的NADPH氧化酶的作用,采用逆转录RT-PCR检测了颈动脉管壁的p22phox和gp91phox的m RNA表达。结果发现模型组p22phox和gp91phox m RNA表达水平显著高于正常组,差异具有统计学意义(P0.01)。LY294002组、PD98059组及通心络低剂量组p22phox和gp91phox m RNA表达水平较模型组差异无统计学意义(P0.05)。与模型组相比,通心络高、中剂量组和阿托伐他汀组p22phox m RNA和gp91phox m RNA表达水平显著降低,差异有统计学意义(P0.01),通心络高剂量组p22phox m RNA和gp91phox m RNA表达水平较阿托伐他汀组明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。3.5颈动脉管壁PI3K/AKT和ERK及VEGF-A/VEGFR-2通路相关蛋白表达各组PI3K蛋白相对表达量组间比较无统计学差异(P0.05)。p-PI3K蛋白相对表达量:与正常组比较,模型组p-PI3K蛋白相对表达量显著增高(P0.01);与模型组比较,通心络高、中剂量组、阿托伐他汀组、LY294002组p-PI3K蛋白相对表达量显著降低,差异有统计学意义(P0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组和LY294002组p-PI3K蛋白相对表达量显著降低,差异有统计学意义(P0.01)。p-PI3K/PI3K水平:与正常组比较,模型组p-PI3K/PI3K水平显著增高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,通心络高、中剂量组、阿托伐他汀组和LY294002组p-PI3K/PI3K水平显著降低,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组和LY294002组p-PI3K/PI3K水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。各组AKT蛋白相对表达量组间比较无统计学差异(P0.05)。p-AKT蛋白相对表达量:与正常组比较,模型组p-AKT蛋白相对表达量显著增高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,通心络高、中剂量组、阿托伐他汀组、LY294002组p-AKT蛋白相对表达量显著降低,差异有统计学意义(P0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组和LY294002组p-AKT蛋白相对表达量降低显著,差异有统计学意义(P0.01)。p-AKT/AKT水平:与正常组比较,模型组p-AKT/AKT水平显著增高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,通心络高、中剂量组、阿托伐他汀组、LY294002组p-AKT/AK水平显著降低,差异有统计学意义(P0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组和LY294002组p-AKT/AKT水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。各组MEK蛋白相对表达量组间比较无统计学差异(P0.05)。p-MEK蛋白相对表达量:与正常组比较,模型组p-MEK蛋白相对表达量显著增高(P0.01),差异有统计学意义;与模型组比较,通心络高、中剂量组、PD98059组p-MEK蛋白相对表达量降低显著,差异有统计学意义(P0.01),阿托伐他汀组p-MEK蛋白相对表达量明显降低(P0.05);与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组和PD98059组p-MEK蛋白相对表达量显著降低(P0.05)。p-MEK/MEK:与正常组比较,模型组p-MEK/MEK水平显著增高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,通心络高、中、剂量组、PD98059组p-MEK/MEK水平显著降低,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组和PD98059组p-MEK/MEK水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。各组ERK蛋白相对表达量组间比较无统计学差异。p-ERK蛋白相对表达量:与正常组比较,模型组p-ERK蛋白相对表达量显著增高(P0.01);与模型组比较,通心络低、中剂量组和他汀组p-ERK蛋白相对表达量有一定程度的降低,但无统计学意义(P0.05)。通心络高剂量组、PD98059组p-ERK蛋白相对表达量显著减低(P0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组和PD98059组p-ERK蛋白相对表达量明显降低(P0.05)。p-ERK/ERK水平:与正常组比较,模型组p-ERK/ERK水平显著增高(P0.01);与模型组比较,通心络中、高剂量组、PD98059组p-ERK/ERK明显降低,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组和PD98059组p-ERK/ERK水平降低明显,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。VEGF-A和VEGFR-2蛋白相对表达量:与正常组比较,模型组VEGF-A和VEGFR-2蛋白相对表达量显著增高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,通心络高、中剂量组、阿托伐他汀组、LY294002组和PD98059组VEGFR-A显著降低,差异有统计学意义(P0.01),通心络中剂量组、LY294002组和PD98059组VEGFR-2降低明显,差异有统计学意义(P0.05),通心络高剂量组和阿托伐他汀组VEGFR-2降低显著,差异有统计学意义(P0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高剂量组、LY294002组降低明显,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。3.6免疫组化染色检测颈动脉管壁p-AKT、p-ERK的定位表达p-AKT阳性物为棕黄色颗粒状,主要位于细胞核或细胞质中。正常组颈动脉组织内膜、中膜及外膜均可见p-AKT阳性表达,在外膜p-AKT仅少量表达,模型组外膜p-AKT呈强阳性表达,微血管内皮细胞及部分成纤维细胞表达呈阳性;通心络高、中剂量组、阿托伐他汀组、LY294002组外膜p-AKT阳性表达较模型组明显减弱。p-ERK阳性物为棕黄色颗粒状,主要位于细胞核或细胞质中。正常组颈动脉内膜、中膜及外膜p-ERK仅少量阳性表达;模型组p-ERK在血管外膜呈强阳性表达,微血管内皮细胞及部分成纤维细胞表达呈阳性,通心络高、中剂量组、阿托伐他汀组和PD98059组,外膜p-ERK阳性表达较模型组明显减弱。结论： 1本研究以脉络学说为指导,基于孙络与微血管在解剖形态学上的同一性,指出了动脉管壁“孙络—微血管”是营气(血管内皮)与卫气(血管外膜及神经—内分泌—免疫网络)“由络以通,交会生化”重要场所。营卫“由络以通,交会生化”功能障碍导致的管壁微血管新生是AS发病的重要病理因素,通过抑制“孙络—微血管”新生能够延缓或减轻AS早期的血管病变。通过高脂喂养联合颈动脉套管置入术建立颈动脉损伤的复合动物模型,可见管壁微血管病理性新生,新生内膜形成,加用抑制剂抑制管壁微血管新生,内膜增生减轻,从而证实管壁微血管新生促进了AS早期血管病变的发生发展。本实验为上述理论学说提供了实验依据,为AS早期防治寻找到有效的治疗策略和干预药物。2颈动脉管壁的神经内分泌失衡参与AS早期管壁微血管新生。在AS早期,动脉管壁发生神经重构,即在于中膜—外膜交界区域的去甲肾上腺素能神经一定程度上消失,但外膜区域去甲肾上腺素能神经再生,以血管外膜局部去甲肾上腺素能神经较胆碱能神经占相对优势。在微血管新生过程中,颈动脉管壁的神经内分泌调节失衡,表现为外膜NGF、NPY及颈动脉管壁α1-AR、α7n Ach R蛋白表达明显增加。3外膜氧化应激是促进AS早期管壁微血管新生的重要机制。随着管壁p22phox和gp91phox基因表达明显升高,外膜ROS生成明显增多,VEGF-A、VEGFR-2蛋白表达上调,管壁微血管新生显著增加。外膜局部使用阻断剂后,明显抑制了PI3K/Akt及ERK通路的激活,同时下调VEGF-A、VEGF-R2蛋白表达,有效减少了微血管新生,说明PI3K/Akt与ERK是氧化应激调节管壁微血管新生的重要信号通路。4通心络有效抑制AS早期管壁微血管新生,减轻了血管内膜增生,其中通心络中剂量与阿托伐他汀疗效相当,而通心络高剂量效果明显优于阿托伐他汀,其机制与调节管壁神经内分泌的失衡,降低外膜氧化应激水平有关。通心络抑制管壁的神经重构,下调外膜局部NGF、NPY和管壁α1-AR、α7n Ach R蛋白表达;减少管壁p22phox、gp91phox基因表达和外膜ROS生成,抑制下游PI3K/Akt、ERK通路激活,下调VEGF-A、VEGFR-2蛋白表达,从而抑制管壁微血管新生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5

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