转录因子MEF2A、KLF2在血管性疾病中的临床和基础研究

发布时间：2018-04-04 05:27

本文选题：MEF2A　切入点：基因突变　出处：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景冠心病(CAD)在国内外发病率和病死率均较高,一直以来是临床及基础医学的研究热点,其发病机制方面的研究近年来取得很大进步。冠心病作为一种多基因疾病,吸烟、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高血压和糖尿病在冠状动脉粥样斑块病变的发生及发展中发挥了至关重要的作用。随着分子生物及遗传检测手段的不断进展,遗传关联研究和全基因组连锁分析发现了一些与CAD相关的易感基因位点和候选基因,研究已证明这些位点和基因直接参与冠心病的发病机制及相关危险因素的调控。但由于冠心病是一种多因素复杂疾病,单个易感基因在疾病发生、发展中所发挥的作用可能很弱小,这也是目前冠心病包括心肌梗死(MI)的基因研究明显滞后于其他疾病的原因。然而以往的研究也表明,CAD/MI可以在一些家系中呈常染色体显性遗传。研究者发现转录因子家族成员——肌细胞特异性增强因子2A(MEF2A)参与了CAD的常染色体显性遗传形式,首次提出MEF2A为冠心病致病基因的观点,引起世界学者广泛关注。2003年,Wang Q在美国发现了一个符合常染色体显性遗传模式的白人家系,21个成员中有9个罹患冠心病,对家系成员进行全基因组分析发现每个CAD成员的MEF2A基因都存在突变,突变位置在第11外显子1320到1341位点,这一位置有21个碱基缺失。在一项对207名经冠脉造影证实的CAD/MI患者进行的基因分析研究中发现：1.93%的患者携带有MEF2A突变。这些初步的研究提示MEF2A变异参与CAD/MI的发病,但这个假设并没有得到进一步的支持。Weng等研究者对这一观点提出了质疑,他们在300例早发冠心病的白种人中进行MEF2A基因的检测,然而并未发现MEF2A基因多态性和冠状动脉疾病的易感性之间的联系。一项爱尔兰人群MEF2A基因的大规模研究显示,MEF2A基因第11号外显子21-bp缺失与缺血性心脏病无相关性。分析上述两种截然不同的研究结果,我们认为MEF2A突变可能是一种罕见的、只存在于少数家系的冠心病致病基因。MEF2A突变是否与我国的冠心病家系的发病机制相关,结论将需要更多的中国CAD/MI家系基因研究来证明。目的1.根据冠心病、心肌梗死的诊断标准,在中国早发冠心病人群中筛选合适病例,进行家系调查,选择理想的CAD/MI家系；2.研究分析冠心病家系的遗传特征、传统危险因素、脂类代谢情况、冠状动脉病变情况；3.进行家系全基因组连锁分析,筛选CAD/MI候选基因,基因测序,寻找有意义的基因突变；4.研究中国冠心病家系中MEF2A基因第1-11外显子的基因突变情况,与散发冠心病及健康人群对照,分析MEF2A基因突变与我国CAD/MI家系的关系。研究方法1.通过病案检索临床诊断明确的早发冠心病患者,进行家系调查,筛选符合显性遗传特征的家系作为研究对象。研究采用的冠心病或心肌梗死的诊断标准为下述条件中至少存在两个：(1)胸痛；(2)心电图改变符合急性心肌梗死演变并与心肌酶／肌钙蛋白显著升高相一致；(3)冠状动脉CT或冠状动脉造影血管腔直径狭窄率超过50%。通过筛选,确定研究家系。所有的家系成员均进行体格检查、血液分析检验(血常规、肝肾功、血糖、血脂及血离子分析)、冠状动脉病变评估,并进行标准化的随访,包括病史、活动耐力、药物史和个人的生活习惯。2.收集以首发心肌梗死入院并行冠状动脉造影检查证实血管病变的散发冠心病患者(n=311)作为散发CAD对照组；健康对照组(n=323)是经过冠脉造影或冠状动脉CT排除冠心病的健康人群,且无早发冠心病家族史。3.微阵列比较基因组杂交(aCGH)分析：利用全血DNA提取试剂盒提取所有受试者的基因组DNA。aCGH分析冠心病家系中CAD/MI患者样本中的DNA,正常人基因组DNA作为一个参考,我们用间隔5-kb的寡核苷酸微阵列高精度覆盖整个基因组,拷贝数变异由患者cDNA样本与正常对照之间log2比值确定。4. MEF2A基因检测：采用Taq DNA聚合酶扩增所有家系成员MEF2A基因所有外显子和内含子-外显子边界区域。引物序列包括MEF2A基因外显子1-11。利用单链构象多态性分析(SSCP)分析PCR扩增产物,出现异常条带的PCR产物克隆到pGEM T easy载体扩增,使用ABI 3100遗传分析仪测序,与CAD对照组、正常对照组测序结果进行对照分析。结果1.成功筛选并确定了一个有34个家庭成员(5人死亡)的CAD/MI大家系,共包括20名女性和14名男性,该家系四代均无近亲婚配。先证者是一名女性,36岁发病,冠状动脉造影(CAG)显示严重前降支病变,狭窄超过80%,无吸烟、高血压、糖尿病及高脂血症,符合早发冠心病诊断。此家系共发现7名现存活的CAD/MI患者,包括先证者的母亲、两个姐姐,一个哥哥、表哥和侄女均有早发冠心病(PCAD)症状及表现。2.家系成员CAD危险因素分析示：家庭中仅有几个成员有血清总胆固醇和甘油三酯轻度升高,但血清低密度和高密度脂蛋白均正常,家庭成员均没有吸烟、高血压病、糖尿病和肥胖病史。多元Logistic回归分析家系成员的年龄、体重指数、胆固醇、甘油三酯水平、空腹血糖等因素与CAD/MI均无相关性。3.家系具有以下遗传特点：我们分析该家系的CAD/MI遗传特点为：发病不分男女性别,符合常染色体遗传；4代人均有发病,第3代患病人数达55.6%(5/9),患者双亲中必有一方也患病,正常亲属后代未发病,这些特点符合显性遗传特点。4.微阵列CGH分析：家系中7例CAD/MI患者的染色体15q26中都存在50-kb的片段染色体拷贝数差异(Iog2 ratio means-0.3),这一区域包含11个重要的基因(POTEB, CXADRP2, LOC646214, GOLGA8C,OR4M2,OR4N4, LOC650137, MEF2A, OR4F4, WASH3P and FAM138E),经文献检索发现其中只有MEF2A基因与CAD的发病相关,MEF2A成为最强的候选基因。5. MEF2A基因检测：(1)在家系的所有成员MEF2A基因的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10外显子SSCP分析均未发现有异常条带；(2)在家系的所有7个CAD/MI患者和非CAD/MI的5个成员基因检测均发现MEF2A第11外显子存在6个碱基对(CAGCCG)缺失；(3)这6个碱基对(bp)缺失位于MEF2A基因cDNA序列的1671至1676位置；(4)第11外显子缺失的序列之中含一个CAG序列,其前方还有n个CAG重复序列；(5)家系中没有6-bp缺失的成员均为正常表型,未发生CAD,其他存在6-bp缺失而未发生冠心病的5名家庭成员均未满40岁；(6)CAD对照组311个CAD患者和正常对照组323健康人的MEF2A基因外显子11编码区域均未发现6-bp缺失,也未发现国外研究报道过的21-bp缺失。结论1.本研究成功筛选出具有显性遗传特征的中国冠心病家系,年龄、血压、吸烟、血脂、血糖、体重指数等常见危险因素与家系成员冠心病发生无相关性,证明家族遗传因素是部分人群冠心病发生的重要原因。2.首次在中国家系研究中发现一种家族遗传型冠心病与新发现的MEF2A基因突变密切相关,这种突变是位于MEF2A基因的第11外显子6碱基(CAGCCG)缺失,是人类MEF2A基因中发现一种新的突变类型。3.本研究在散发CAD及正常对照组人群中未发现MEF2A基因的第11外显子6碱基(CAGCCG)缺失以及国外研究报道过的21-bp缺失,我们认为MEF2A基因第11外显子突变与我国散发冠心病的发生无关,可能是部分CAD家系的致病基因。研究背景及目的动脉粥样硬化(AS)性疾病是当今危及人类生命和健康的主要疾病之一。在众多的致病机制中,血管内皮功能障碍既是动脉粥样硬化的始动环节,也是其发生和发展的基础。血糖代谢异常与动脉粥样硬化关系十分密切。糖尿病目前是动脉粥样硬化(AS)和冠心病(CHD)最主要的危险因素。糖尿病患者无论是否已强化降糖治疗与非糖尿病患者相比,动脉粥样硬化病变进展明显加速。国际大规模随机临床实验的结果表明,AS高危人群完全戒烟、严格控制血压和血脂水平,可显著降低心血管病发病率和死亡率。然而,ACCORD、ADVANCE和VA Diabetes trials等大规模临床实验显示,在合并糖尿病的AS高危人群中将糖化血红蛋白水平控制到正常水平,虽可降低微血管病变的发生率,但却显著增加大血管病变的死亡率。这些临床实验的结果表明：吸烟、高血压和高胆固醇血症与心血管事件是直线相关的因果关系,但血糖水平与心血管事件的关系并非如此。糖尿病促AS形成可能存在其它的分子机制和干预靶点,尚需更加深入的基础研究加以阐明。目前研究认为,高血糖可直接损伤血管内皮细胞,诱导黏附分子、趋化因子等炎性介质释放,激活炎症反应,还可通过引起氧化应激、脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、糖基化终产物增加导致血管内皮细胞功能紊乱,是动脉粥样硬化形成中的重要影响因素。高血糖引起血管内皮功能障碍的发生机制非常复杂,许多细胞因子、信号通路的作用目前还不十分明确,寻找血糖控制以外的其它干预保护措施也是防治糖尿病动脉粥样硬化的重要环节。Kruppel样因子(KLF)是具有锌指结构的转录因子的一个亚家族。研究结果显示KLF2可以参与调节血管炎症、凝血、血管舒缩和生成等多种过程,直接或间接保护内皮功能,是AS形成过程中重要的转录因子,并且是他汀类药物的重要作用靶点,因此在AS形成过程中具有重要的作用。KLF2对糖尿病动脉粥样硬化的影响至今尚未见有关研究报道,根据以往的基础研究我们推测KLF2在高血糖与血管内皮功能障碍的发生机制中也应发挥重要的作用。本研究的目的通过体外实验探讨转录因子KLF2在高糖条件下是否对血管内皮功能具有重要的保护作用,阐明可能的分子机制及干预措施,为防治糖尿病动脉粥样硬化提供重要治疗靶点。材料与方法1.细胞培养及存活率测定：离体培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),用不同浓度梯度及时间梯度的高糖干预,MTT比色法测定细胞存活率最终确定高糖诱导HUVEC细胞模型为25.5mmol/L的D-葡萄糖诱导24h。2.细胞干预：采用25.5mmol/L高糖及不同浓度阿托伐他汀、罗格列酮实现对人脐静脉内皮细胞KLF2表达的干预,以SB203580来抑制p38MAPK活性,分别采用5.6mmol/L葡萄糖、5.6mmol/L葡萄糖+19.9 mM甘露醇干预细胞作对照组。3. RT-PCR:收集各组细胞,提取RNA,进行逆转录和定量PCR,分别检测各组细胞中KLF2、PPARγ、VCAM-1和ICAM-1 mRNA的表达水平。4. Western blotting:收集各组细胞,提取蛋白,分别检测KLF2、VCAM-1、ICAM-1、p38MAPK、 p-p38MAPK、PPARγ的蛋白表达水平。5.NO检测：收集各组细胞上清液,采用试剂盒检测NO释放。研究结果1. 与5.6mmol/L葡萄糖及5.6mmol/L葡萄糖+甘露醇组对照,25.5mmol/L高糖刺激脐静脉内皮细胞24h可明显减低KLF2 mRNA及蛋白的表达,增高炎性因子VCAM-1、ICAM-1水平,减少NO的释放,KLF2与VCAM-1、ICAM-1、NO变化趋势显著相关；2. 以阿托伐他汀(0.1μM,1μM,10μM)、罗格列酮(0.1μM,1μM,10μM)分别干预高糖刺激的HUVECs能明显增加KLF2表达和NO的释放,降低VCAM-1、 ICAM-1蛋白和mRNA表达,这种改变在阿托伐他汀组呈剂量依赖性,药物浓度越高越明显；3.与对照组比较,高糖刺激后的HUVECs磷酸化的p38 MAPK表达增强,给与p38 MAPK特异性抑制剂SB203580后,KLF2的表达增加；中等浓度阿托伐他汀、罗格列酮(1μM)就能明显抑制高糖对HUVEC p38 MAPK的磷酸化作用。结论1.高浓度葡萄糖能诱导人脐静脉内皮细胞的炎症因子VCAM-1、ICAM-1表达增加,减少舒张因子NO的释放,导致血管内皮功能障碍,内皮功能保护性转录因子KLF2能部分抑制高浓度葡萄糖所引起的炎症反应,保护血管内皮功能；2.高浓度葡萄糖可以通过p38 MAPK途径抑制HUVECs KLF2表达；3.阿托伐他汀、罗格列酮可以通过改善高糖对HUVECs转录因子KLF2的抑制作用,减少炎性因子VCAM-1、ICAM-1的表达,增加NO的释放。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.4

【参考文献】