CEPO对高糖环境下体外培养心肌细胞的影响及GSK-3β-Smad3信号通路在其中的作用

发布时间：2018-04-16 16:35

  本文选题：CEPO + 心肌细胞　； 参考：《昆明医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：[目的]本实验通过在体外模拟一个近似人体内高糖的特殊环境,观察心肌细胞(Cardiaomyocyte,CM)在高糖环境下的生理及可能的病理情况,并进一步探讨氨甲酰化促红细胞生成素(Carbamylated erythropoietin C-EPO)对高糖环境诱导下体外培养乳鼠心肌细胞的作用及GSK-3 β/Smad3信号通路在其中的作用。为高糖促进心肌细胞肥大提供进一步的理论支持、探究CEPO高糖环境对心脏重构是否具有保护作用及可能的机制,并对糖尿病心肌病未来的治疗方法提出可行的理论依据。[方法](1)CM的培养:取出生1-3天的SD大鼠的心室肌,利用胰蛋白酶+Ⅱ型胶原酶双酶消化法消化心肌组织,采用差速贴壁离心法分离,培养CM使用搏动性良好的48h-72h细胞。(2)CEPO的合成:采用Leist法,利用EPO和氰酸盐进行合成。(3)药物干预:在细胞培养的过程中利用高糖培养基(葡萄糖的终浓度25mmol/L)进行培养,诱导心肌细胞肥大,在此过程中加入CEPO和/或GSK3 β信号通路阻滞剂SB216273进行干预。分别将同一批细胞随机分为6组:对照组(葡萄糖终浓度为5.5mmol/L)、高糖诱导组(葡萄糖终浓度为25mmol/L)、空白+CEPO 组(葡萄糖终浓度为 5.5mmol/L+20U/mlCEPO)、高糖+CEPO干预组(葡萄糖终浓度为25mmol/L+20U/ml CEPO)、高糖+EPO干预组(葡萄糖终浓度为25mmol/L+20U/mlEPO)、高糖+SB216763干预组(葡萄糖终浓度为 25mmol/L+3μMSB216763)。(4)蛋白免疫印迹法(Western blot)检测糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3 βGSK-3β)及 GSK-3β/Smad3 信号通路中Smad3的表达并分析上述蛋白的相对表达量。(5)实时荧光定量PCR:将培养的CM细胞进行随机分组,给予药物干预后提取细胞的总RNA并进行逆转录,采用实时荧光定量PCR检测GSK-3 β、Smad3的mRNA的相对表达量。[结果](1)CM细胞分离培养后3-5h开始贴壁生长,培养24h后,细胞基本贴壁,少部分细胞伸出伪足,并开始出现自主搏动;继续培养到60-72h,可见CM伪足交织成网,视野内90%细胞呈现同步搏动。CM呈星型、多边型等多种形态,可自发性搏动。(2)免疫组织化学法鉴定CM细胞:利用PV通用型两步法免疫组织化学试剂盒鉴定CM细胞。免疫组化结果Fibronectin1(-)、Vimentin(-)、α-actin(+),证实培养的细胞为 CM 细胞。(3)Western blot 结果:①与空白对照组相比,高糖组GSK-3β的表达下降,Smad3、P-GSK-3β的表达升高;②与高糖组相比,CEPO组与EPO组GSK-3 β的表达均有明显升高,Smad3表达下降,P-GSK-3 β的表达降低;③与EPO组相比,CEPO组GSK-3β表达升高更明显,Smad3的表达下降较明显,而P-GSK-3β的表达无明显差异。[结论](1)CEPO、EPO可以抑制高糖环境下离体培养心肌细胞的肥大;(2)Smad3参与了心肌细胞肥大的病理过程,并且GSK-3 β可以直接抑制Smad3的表达,GSK-3β是心肌细胞肥大的负向调节因子;(3)在抑制离体培养乳鼠心肌细胞肥大的过程中,CEPO的作用优于EPO。
[Abstract]:[objective] to observe the physiological and pathological changes of cardiac myocyte cardiomyocyteus (CMCM) in high glucose environment by simulating a special environment similar to high glucose in human body in vitro.The effects of Carbamylated erythropoietin C-EPO) on cultured neonatal rat cardiomyocytes induced by high glucose environment and the role of GSK-3 尾 / Smad3 signaling pathway in vitro were further investigated.To provide further theoretical support for hypertrophy of cardiomyocytes promoted by high glucose, to explore the protective effect and possible mechanism of CEPO high glucose environment on cardiac remodeling, and to provide a feasible theoretical basis for the future treatment of diabetic cardiomyopathy.[methods] in vitro culture, ventricular muscle of Sprague-Dawley rats (1-3 days old) was taken out, myocardial tissue was digested by trypsin 鈪，

本文编号：1759774