大鼠骨髓间充质干细胞来源的Exosomes对心脏干细胞功能影响的实验研究

发布时间：2018-05-02 02:15

  本文选题：心脏干细胞 + 骨髓间充质干细胞　； 参考：《苏州大学》2015年博士论文

【摘要】：背景:干细胞移植治疗心肌梗死(myocardial infarction,MI)已成为全球一大热点。干细胞能够促进血管发生、恢复血供,再生梗死的心肌组织,促使心脏结构和功能性恢复。目前研究报道,可供选择的种子细胞包括间充质干细胞(MSCs)、胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能干细胞(i PS)、内皮祖细胞(EPCs)、心脏干细胞(CSCs)等。其中,CSCs因更易向心肌系细胞分化,在治疗MI方面被认为具有巨大潜力。经过多年的动物实验和临床试验研究,现已证实CSCs能够促进受损心肌的修复。然而,CSCs移植治疗MI仍存在着一些困扰,即干细胞存活定植、分化能力欠佳。因此,为了增强CSCs的修复心肌的能力,目前报道的方法有多种,主要包括基因修饰、组蛋白修饰、缺氧预处理等。现已证实BMSCs-Exosomes具有促进MI区域血管发生、降低心梗面积的能力。另外,有研究报道乳腺癌细胞经BMSCs-Exosomes刺激后,其迁移/侵袭能力明显增强。利用BMSCs-Exosomes刺激CSCs,是否能够促进CSCs活化、提高CSCs分化能力,增强CSCs心肌修复功能?这些问题目前仍未有研究报道。本课题拟以Exosomes为手段预处理CSCs,旨在为提高CSCs的心肌修复功能;并进一步通过micro RNA基因芯片检测,探讨分析CSCs功能改善的基因调控机制。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养,及Exosomes的提取第一节MSCs的分离、培养和鉴定目的:从大鼠的骨髓中分离出具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)。为进一步获取Exosomes作准备。方法:SD大鼠全骨髓细胞贴壁培养,多次传代纯化。对分离纯化的MSCs进行多方面鉴定:流式细胞术鉴定BMSCs表面标记抗原的表达;绘制MSCs生长曲线;检测MSCs的细胞周期。结果:全骨髓细胞贴壁培养14天左右,基本已铺满培养皿,融合达90%以上。传代后,细胞增殖速度明显加快,4-6天即可传代一次。细胞形态比较均一,呈纺锤形。流式鉴定:超过90%BMSCs表达CD29、CD90和CD44,但不表达CD34。P3 MSCs生长曲线呈现:细胞接种后前2天为潜伏期生长;第3天,细胞开始增殖;第4、5、6天扩增明显加速,进入对数增殖期;第7天增殖达到高峰,进入平台期。流式细胞仪检测P3 MSCs细胞周期:G0/G1期占88.15%,G2期为1.73%,S期(G3)为10.12%,大部分细胞处于静止期,符合干细胞特征。结论:利用大鼠全骨髓细胞,贴壁传代培养,至P3可使MSCs得到纯化,有效的培养出大鼠BMSCs。第二节BMSCs来源Exosomes的提取、鉴定目的:从P3 BMSCs培养上清液中提取具有特定形态、大小和膜标记物的Exosomes。为进一步应用Exosomes处理CSCs做准备。方法:应用Exosomes提取试剂盒,按说明抽提P3 BMSCs培养上清液中的Exosomes。利用BCA试剂盒测定Exosomes的浓度。对Exosomes进行鉴定:透射电镜下观察Exosomes的大小、形态;流式细胞术鉴定Exosomes表面CD63的表达量;Western Blot检测Exosomes中CD63的蛋白表达量。结果:经BCA试剂盒测定,Exosomes蛋白浓度较高,达1896.7mg/ml。对Exosomes鉴定:透射电镜下观察,Exosomes大小不一、圆形或椭圆形,呈囊状小泡,腔内可见低密度光亮区,平均直径为46.55±11.64(11-98nm);经流式细胞术检测,CD63的表达量为96.7%;经Western Blot检测,CD63蛋白为阳性表达。结论:试剂盒抽提的Exosomes浓度较高。经透射电镜、流式细胞术和Western Blot鉴定,符合Exosomes形态及特征。试剂盒抽提Exosomes简便、省时、高效。第二部分大鼠心肌梗死模型的建立目的:气管插管开胸直视下,行大鼠冠状动脉前降支(LAD)结扎,建立大鼠心肌梗死模型。方法:17只SD大鼠,体重250g-300g,分为两组:MI组(10只)和对照组(7只)。MI组在气管插管下,开胸直视结扎大鼠冠状动脉前降支(LAD)。判断心梗模型是否成功建立:结扎前后检测心电图;术前、术后4周行多普勒超声心动图检查;术后4周获取大鼠心脏组织,行HE染色和Masson’s Trichrome染色分析。结果:MI组大鼠手术成活率80%。冠脉结扎后,心电图提示I、II、III、a VF导联ST段抬高明显;MI建立后4周行心脏彩超检查,EF和FS值较对照组均明显降低(P0.01,P0.01),LVEDD和LVESD较对照组均明显增大(P0.01,P0.01);HE染色,MI组可见肌纤维增粗变性、坏死,轮廓模糊;MT染色提示MI组有大量呈蓝色的胶原沉积,存活红色心肌少见。结论:气管插管开胸,直视下结扎大鼠冠状动脉前降支(LAD),可以成功建立大鼠心肌梗死(MI)模型。第三部分大鼠心脏干细胞(CSCs)的分选和培养目的:利用免疫磁珠分选法(MACS),从新生3-5天SD大鼠心脏中获取c-kit+心脏干细胞(CSCs)。为进一步研究CSCs功能作准备。方法:获得新生3-5天SD大鼠心脏,利用胶原酶消化和MACS分选法提取c-kit+CSCs,传代培养。对分选的CSCs进行鉴定:流式细胞术鉴定P0 CSCs c-kit阳性率;免疫荧光观察CSCs中c-kit及Ki67的表达;CSC经诱导分化,免疫荧光观察c Tn I、Desmin、Connexin 43、α-SMA、CD31的表达。结果:应用胶原酶和MACS分选法获得的CSCs形态均一,呈小、亮、圆形或梭形,生长较缓慢。经流式鉴定,c-kit+阳性率达91.5%;同时免疫荧光观察到c-kit和Ki67呈阳性表达;经诱导分化的CSCs,表达c Tn I、Connexin43、Desmin、α-SMA和CD31荧光。结论:利用MACS分选获得的CSCs纯度较高,具有自我更新和向心肌系细胞分化的潜能,符合CSCs形态和特征。第四部分大鼠骨髓间充质干细胞来源的Exosomes对心脏干细胞功能以及心肌修复能力的影响目的:观察经Exosomes处理后的CSCs在迁移、血管形成、扩增能力等方面的功能变化,及其移植治疗大鼠MI心肌修复的功能作用。方法:首先,将Di I标记的Exosomes加入CSCs培养基中,荧光观察CSCs内吞Exosomes;其次,在不同浓度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml, 800μg/ml)的作用下,应用CCK-8法观察不同浓度Exosomes对CSCs扩增能力的影响;应用Transwell小室,观察不同浓度Exosomes对CSCs迁移能力的影响;利用Matrigel基质胶,观察不同浓度Exosomes对CSCs血管形成能力的影响;然后,将经400μg/ml Exosomes预处理的CSCs和正常培养的CSCs局部心肌注射治疗大鼠MI,观察比较Di I-CSCs在心脏中短期存活的数量;免疫荧光观察比较心梗周边区域新生毛细血管密度和CSCs-GFP向血管分化的数量;心脏彩超检查观察比较心功能变化;MT染色观察比较心梗面积差异。结果:(1)Di I标记的Exosomes加入CSCs培养基中,观察到CSCs表面呈现红色Di I荧光,说明CSCs内吞了Exosomes。(2)在不同浓度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml)的作用下,应用CCK-8法检测CSCs的增殖能力,呈现为低浓度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml)刺激,OD值变化不大;高浓度Exosomes组(200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml)的OD值明显高于低浓度组,但在高浓度Exosomes组的组间OD值无差异。应用Transwell小室检测CSCs的迁移能力,呈现为低浓度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml)刺激,CSCs迁移能力无显著变化;但随刺激浓度增加,其迁移能力显著增加。应用Matrigel基质胶检测CSCs血管形成的能力,呈现为低浓度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml)刺激,形成Tube长度无显著差异;但随刺激浓度增加,Tube长度亦显著增加,然而400μg/ml和800μg/ml组间Tube长度无差异。(3)CSCs移植治疗MI,CSCsExo组CSCs-Di I短期(10天)存活量在心梗区域(IZ)和心梗周边区域(BZ)均显著多于CSCs组(P0.01,P0.01);CSCsExo组和CSCs组大鼠在术后28天EF值均显著高于Control组(P0.01,P0.01);CSCsExo组BZ中新生毛细血管密度以及CSCs-GFP向血管分化的数目均明显多于CSCs组(P0.01,P0.01);CSCsExo组心脏纤维化面积和长度均显著小于CSCs组(P0.01)。结论:在体外实验中,BMSCs-Exosomes具有提高CSCs扩增、迁移和血管形成的能力,并呈浓度依赖性;Exosomes对CSCs扩增和血管形成能力的影响具饱和性,且Exosomes浓度在400μg/ml时可达到饱和状态。在体内实验中,Exosomes具有促CSCs存活、促新生毛细血管生成、促CSCs向血管分化,降低心梗面积,提高CSCs心肌修复的能力。mi RNA-326-5p在CSCs血管生成中的作用第五部分大鼠心脏干细胞的基因芯片分析及第一节大鼠心脏干细胞的基因芯片分析目的:对CSCs组和CSCsExo组两种不同状态的CSCs行micro RNA基因芯片检测,找出差异micro RNA进行分析。方法:采用Affymetrix基因芯片,对CSCs组和CSCsExo组(400μg/ml Exosomes预处理)两组细胞行大鼠micro RNA芯片表达谱检测,实验重复3次。找出差异表达的micro RNA,进行生物信息学分析。结果:CSCs组和CSCsExo组经micro RNA芯片检测,差异表达的mi RNA有23个,其中5个显著下调,17个显著上调。mi R-326-5p变化最为显著,下调7.14倍。GO分析呈现:这些差异表达明显的mi RNAs,它们预测的靶基因参与的细胞生物功能较为广泛,其中包括信号转导、正性调节细胞扩增、内吞、正性调节细胞迁移、细胞粘附、心脏发生、血管形成等。Pathway分析呈现:差异显著mi RNAs预测的靶基因参与广泛的信号转导通路,其中包括代谢通路、内吞作用、Wnt信号通路、Hippo信号通路、PI3K/Akt信号通路、VEGF信号通路、趋化信号通路等。mi RNA-Gene-Network分析呈现:mi R-326-5p,mi R-328a-5p,mi R-207,mi R-760-3p,mi R-702-5p这5个下调表达的mi RNA,在网络图中它们的度(Degree)最高,分别为:166、177、188、189、120,即调控的靶基因数目最多。结论:通过基因芯片检测,CSCs经Exosomes处理后有23个mi RNA表达发生明显变化,其中5个下调,17个上调。经过生物信息学分析,差异表达明显的mi RNAs,它们预测的靶基因参与的生物功能包括内吞作用、VEGF信号通路、调节细胞扩增、调节细胞迁移、血管形成等,这些内容中包含了本课题中观察到CSCs经Exosomes处理后发生变化的功能。mi R-326-5p,mi R-328a-5p,mi R-207,mi R-760-3p,mi R-702-5p参与调控的靶基因最多,可能在本实验micro RNA调控CSCs功能中占主导地位。第二节mi RNA-326-5p在CSCs血管形成中的作用目的:进一步验证mi RNA基因芯片结果中感兴趣表达差异最大的mi RNA-326-5p。并探究CSCs经Exosomes处理后,血管形成能力的增强是否与mi RNA-326-5p的表达变化有关?方法:通过q RT-PCR技术,验证基因芯片结果中mi RNA-326-5p的表达情况。应用脂质体转染技术,将mi RNA326-5p inhibitors转染进CSCs,通过q RT-PCR技术验证转染效率;利用Matrigel基质胶,观察CSCs、CSCsExo(400μg/ml Exosomes处理)、CSCsmi R-326-5p i这三组Tube的形成能力。结果:经q RT-PCR验证,mi RNA-326-5p在CSCsExo组中的相对表达量为0.18±0.05,明显受到抑制。mi RNA326-5p inhibitors转染CSCs,经q RT-PCR验证mi RNA326-5p,相对表达量为0.32±0.08,抑制效率明显超过50%。CSCsExo组和CSCsmi R-326-5p i组Tube长度显著大于CSCs组,CSCsExo组和CSCsmi R-326-5p i组组间无差异。结论:经q RT-PCR检测,mi RNA芯片结果中mi RNA-326-5p下调显著得到证实。下调mi R-326-5p的表达可促进CSCs血管生成;经Exosomes处理后,其血管形成能力的提高可能主要通过下调mi RNA-326-5p的表达来实现。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.22

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 Justin D Glenn;Katharine A Whartenby;;Mesenchymal stem cells: Emerging mechanisms of immunomodulation and therapy[J];World Journal of Stem Cells;2014年05期

2 Silvia Berardis;Prenali Dwisthi Sattwika;Mustapha Najimi;Etienne Marc Sokal;;Use of mesenchymal stem cells to treat liver fibrosis:Current situation and future prospects[J];World Journal of Gastroenterology;2015年03期

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本文编号：1831967