菌群及巨噬细胞脂质分解在血脂调节中的作用与机制

发布时间：2018-05-09 16:16

本文选题：NPC1L1 + CGI-58　；参考：《第三军医大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)是中老年最常见的心血管疾病,其主要病理基础为动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)。随着生活水平的提高和饮食习惯的改变,AS发病率呈现出逐年升高的趋势。众多流行病学研究显示,血脂代谢紊乱和炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展中起到了重要的作用,尤其是血液中低密度脂蛋白-胆固醇(Low Density LipoproteinCholesterol,LDL-C)的升高已证实为动脉粥样硬化发生发展的独立危险因素。调控血脂水平的机制极其复杂,除了常见的遗传及环境因素外,近几年研究发现,菌群在代谢性心血管疾病中起到了重要作用,干预菌群能够预防、甚至临床治愈代谢性心血管病,但菌群是否通过改变血脂代谢来影响心血管疾病的发生发展目前尚不明确,仍需要进一步研究。体内胆固醇平衡是由三条主要代谢通路控制,包括自身合成,胆汁粪便排出以及肠道吸收。肠道胆固醇吸收是尼曼匹克C1样蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1,NPC1L1)蛋白介导的主动吸收过程,我们的前期研究证实,NPC1L1基因敲除小鼠不仅有肠道胆固醇吸收缺陷,而且粪便量也明显减少。菌群是粪便的重要组成部分,提示肠道菌群可能参与了NPC1L1基因调节体内胆固醇代谢的过程,但具体机制尚不清楚。早期动脉粥样硬化的重要特征是巨噬细胞来源的泡沫细胞在血管内皮下的沉积。泡沫细胞的主要成分是胆固醇酯和甘油三酯,CGI-58(Comparative gene identification-58)是细胞内脂质分解的激活因子,主要通过激活脂肪甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)的活性促进细胞内脂质分解。我们前期研究发现,CGI-58缺失的巨噬细胞类似泡沫细胞,有大量的甘油三酯(Triglyceride,TG)和胆固醇酯沉积,并呈现促炎表型,但CGI-58导致的脂质紊乱和炎性改变是否对动脉粥样硬化发生发展产生影响目前尚无定论。考虑到泡沫细胞与炎症反应是动脉粥样硬化发生的病理基础,因此,研究巨噬细胞CGI-58与动脉粥样硬化发生发展的相互关系至关重要。研究目的1.探讨菌群对体内胆固醇代谢平衡调节的影响及其在NPC1L1调节胆固醇吸收中的作用及相关机制,筛选与肠道胆固醇吸收相关的肠道菌群为今后进一步研究打下基础。2.建立巨噬细胞特异性CGI-58敲除的动脉粥样硬化模型,在动脉粥样硬化模型基础上探讨巨噬细胞CGI-58对脂质代谢及炎症反应的影响及作用机制。研究内容与方法1.肠道菌群与小鼠体内胆固醇代谢的相关性及可能的作用机制1.1无菌(Germ-free,GF)小鼠是现阶段研究肠道菌群与疾病相关性的一个必要模型,本研究第一部分动物模型选用无菌小鼠和普通无特殊病原体(Specific pathogen-free,SPF)小鼠,并按照在Western Diet中混合或者未混合胆固醇吸收抑制剂依折麦布(Ezetimibe)作为分组标准随机分为SPF+WD饮食组,SPF+WD饮食+Ezetimibe组,GF+WD饮食组,GF+WD饮食+Ezetimibe组。1.2[14C]-cholesterol和[3H]-Sitosterol的同比例混合溶液被灌胃进入小鼠体内,运用双同位素标记法检测各组小鼠粪便中上述同位素的dpm计数,计算出各组小鼠胆固醇肠道吸收率的改变。将5-Cholestene,β-Coprostanl,α-Cholestanone,Cholesterol等胆固醇及其相关甾醇作为标准品,运用气象色谱检测等方法观察计算各组小鼠粪便中胆固醇相关甾醇排出量的情况。1.3选取多种可靠的检测试剂盒,采用萃取技术、酶学分析、ELISA等方法观察小鼠体内血液及组织中生化学指标及胆固醇、甘油三酯、胆汁酸代谢的改变。1.4选定相应的引物序列及抗体,运用Q-PCR、免疫印迹等检测方法检测与胆固醇、胆汁酸代谢相关基因m RNA及蛋白的表达,探索菌群的有无及胆固醇吸收抑制剂的参与对胆固醇及胆汁酸代谢可能的作用机制。1.5联合华大基因测序,选用宏基因组检测方法,筛选出可能的与肠道胆固醇吸收相关的肠道菌群菌属。2.探索巨噬细胞脂质分解在动脉粥样硬化发生发展中的可能作用2.1从条件性巨噬细胞CGI-58敲除和野生小鼠体内分离出腹腔及骨髓巨噬细胞,用动脉粥样硬化危险因子对细胞进行干预,观察这些危险因子对巨噬细胞CGI-58表达的影响及其与CGI-58相互作用对泡沫细胞形成的调控。2.2建立巨噬细胞特异性CGI-58敲除的动脉粥样硬化模型,在西方饮食的作用下,进行体内实验,观察动脉粥样硬化模型下巨噬细胞CGI-58敲除小鼠与未敲除小鼠血液学指标及其在动脉粥样硬化发生发展中的作用。研究结果1.肠道菌群可以通过调节小鼠宿主基因表达水平从而减少体内胆固醇丢失1.1各组小鼠西方饮食和Ezetimibe共同作用后,无菌小鼠较同处理条件的SPF小鼠结肠重量明显增加(P0.01),但其体重、腹腔脂肪、皮下脂肪却显著减少(P0.05)。Ezetimibe的使用加速了这种改变。同时发现,Ezetimibe喂养后,SPF小鼠粪便量降低,无菌鼠却无同样改变(P0.01)。1.2双同位素检测和气象色谱检测结果发现,同样处理条件下,无菌小鼠与SPF小鼠相比较,肠道胆固醇吸收率明显降低(P0.05),粪便中胆固醇及其细菌代谢产物排出量明显增加(P0.05)。Ezetimibe在无菌小鼠中抑制胆固醇吸收和促进粪便胆固醇排泄的作用更强。1.3通过对胆汁中的胆固醇、磷脂及胆汁酸的检测发现,GF与SPF小鼠相比较,胆汁中的胆固醇含量降低(P0.05)。在Ezetimibe处理下,胆汁胆固醇进一步降低,但两组间没有显著变化。1.4运用ELISA和酶学检测方法测量了不同处理小鼠血液及肝脏中的胆固醇、甘油三酯及磷脂等脂质相关指标,发现GF小鼠血浆内的脂质含量均低于SPF小鼠(P0.05),相较于SPF小鼠组,ezetimibe处理能够更明显的降低GF小鼠组内的胆固醇及甘油三酯的含量(P0.05)。肝脏脂质相关指标研究结果提示,相较于SPF小鼠,GF小鼠肝脏中的游离胆固醇,总胆固醇,胆固醇酯,甘油三酯以及磷脂含量显著降低(P0.05)。Ezetimibe处理后能显著降低SPF小鼠和GF小鼠肝脏中的脂质含量,且GF小鼠反应更为明显(P0.05)。1.5在GF小鼠空肠内,与脂肪生成相关的基因如SREBP-1C,FAS以及SCD-1等表达均较SPF小鼠低(P0.05)。与胆汁酸激活相关的基因如FXR,OST-β以及FGF-15在GF小鼠肠道内表达明显下调(P0.05)。另外,与脂蛋白代谢和转运相关的基因,如:HDL受体SR-BI在GF小鼠空肠内较SPF小鼠表达明显增加(P0.01),ezetimibe的处理进一步降低其表达水平;LDL受体在未用ezetimibe处理时SPF小鼠和GF小鼠小肠内未见明显的m RNA改变,但ezetimibe处理后,其m RNA水平在两组小鼠内表达均增加(P0.05)。同时,与胆固醇转运及吸收相关的蛋白也有相应改变,ABCA1和NPC1L1的m RNA和蛋白水平在GF小鼠内均降低(P0.05);ABCG5和ABCG8的m RNA和蛋白水平在GF小鼠内均显著升高(P0.05)。Ezetimibe处理后除了降低了ABCA1的表达外,上述基因表达均为发生明显改变。1.6与SPF小鼠相比,GF小鼠肝脏中与胆固醇合成的酶,如HMG-Co A,HMGCR,HMGCS以及FPPS的m RNA表达均上调(P0.05)。Ezetimibe处理进一步升高这些基因在SPF小鼠和GF小鼠中的表达(P0.05)。GF小鼠中感受细胞内胆固醇水平的核受体LXR的靶基因,如ABCA1,SREBP-1C以及SCD-1与SPF小鼠相比较均表达下调(P0.05),Ezetimibe处理后GF小鼠上述基因表达下调更明显(P0.05)。同时,脂蛋白受体基因如SR-BI和LDLR的m RNA及蛋白表达水平在GF小鼠肝脏中明显增加(P0.05)。另外,在GF小鼠肝脏中,与胆酸代谢的相关基因如FXR m RNA表达下调(P0.05);CYP7A1和CYP7B1 m RNA表达上调(P0.05),CYP7A1蛋白表达也明显增加。1.7宏基因组测序结果显示,NPC1L1基因敲除介导的肠道胆固醇吸收抑制在高脂饮食条件下能够显著改变肠道菌群的组成。2.巨噬细胞脂质分解在动脉粥样硬化发生发展中的作用研究2.1 ox-LDL刺激下THP-1细胞中CGI-58蛋白表达明显下调,同时,ox-LDL刺激原代巨噬细胞后,腹腔和骨髓巨噬细胞内CGI-58的表达也明显下降,以腹腔巨噬细胞改变更为明显。对小鼠腹腔巨噬细胞进行荧光染色后发现,空白刺激情况下巨噬细胞CGI-58敲除后较未敲除组脂滴聚集增多,ox-LDL刺激下,未敲除CGI-58的细胞脂滴聚集增加,巨噬细胞CGI-58敲除后,脂滴聚集更为明显。2.2通过条件性基因打靶技术建立了巨噬细胞CGI-58和Apo E敲除小鼠模型,其基因型为Apo E-/-CGI-58f/f/Cre+(DKO)。DKO小鼠与对照鼠相比,体重增加和生育能力正常。通过检测血浆中胆固醇及脂质代谢相关指标,我们发现,西方饮食饲喂6周后,DKO小鼠相较对照组(Apo E-/-CGI-58f/f)小鼠血浆胆固醇和甘油三酯含量明显增高(P0.01)。初步结果显示,DKO主动脉斑块数量较对照组有所增加。2.3 DKO相较Apo E-/-和WT小鼠糖耐量降低(P0.05),胰岛素抵抗明显增加(P0.05),提示巨噬细胞CGI-58可能也参与了全身血糖代谢调节,但与动脉粥样硬化的关系有待进一步研究。结论1.肠道菌群可能是体内胆固醇平衡调节的重要组成部分。2.肠道菌群可以通过调节相关基因表达,增加肠道胆固醇重吸收,有效的防止体内胆固醇的大量流失。3.厚壁菌门和拟杆菌门细菌的改变可能与NPC1L1调节胆固醇代谢相关。4.动脉粥样硬化危险因子ox-LDL能够降低巨噬细胞内的CGI-58表达,同时巨噬细胞CGI-58可能参与了动脉粥样硬化危险因子刺激的泡沫细胞形成的调控。5.巨噬细胞相关的脂质分解对血脂水平有明显调控作用。
[Abstract]:Background : Coronary atherosclerotic heart disease ( CHD ) is the most common cardiovascular disease in the middle and old age , and its main pathological basis is atherosclerosis ( AS ) . In addition to the common genetic and environmental factors , it has been found that the mechanism of lipid metabolism disorder and inflammatory response plays an important role in the development of atherosclerosis . The effects of cholesterol , triglyceride and bile acid metabolism on cholesterol and bile acid metabolism in mice were determined by means of double isotope labeling . Compared with SPF mice , the levels of free cholesterol , total cholesterol , cholesterol , cholesterol , cholesterol , cholesterol , cholesterol , triglyceride and phospholipid in GF mice were significantly lower than SPF mice ( P0.05 ) . Conclusion : Compared with control group , there was a significant increase in plasma cholesterol and triglyceride levels in mice compared with control group ( P0.05 ) .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.4

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