脂肪来源Exosome与TRB3介导的管周脂肪炎症在糖尿病血管病变中作用的研究

发布时间：2018-05-21 12:38

  本文选题：糖尿病 + 脂肪　； 参考：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：1研究背景糖尿病是冠状动脉粥样硬化性心脏病等危症的概念已深入人心。多项糖尿病防治指南都将糖尿病是心血管事件独立危险因素、糖尿病患者是心血管疾病的高危人群的观点纳入指南。众多临床试验及荟萃分析结果显示,糖尿病患者的心血管疾病发病更早,病变范围更广并且程度更重,预后更差。目前的循证医学证据表明,严格控制空腹血糖与糖化血红蛋白可以显著降低糖尿病微血管并发症,但对于糖尿病大血管并发症的作用仍存在争议。强化降糖组死亡率较高的情况,提示血糖和胰岛素水平的改变不是导致糖尿病患者急性冠脉综合征的核心因素。因此,探索血糖因素之外的糖尿病血管损伤因子,对于发现糖尿病患者心血管并发症风险增高的深层次机制、防治糖尿病血管病变有着重要意义。众多的动物与临床试验明确了脂肪组织与心血管病变的密切联系。控制体重可以缓解脂肪组织功能失调,降低心血管病事件风险。糖尿病患者体内的脂肪组织发生功能失调,表现为慢性、亚临床状态的炎症状态。糖尿病状态下失衡的脂肪中发生慢性炎症,同时循环中脂肪相关炎症因子升高。但是脂肪组织中的脂肪因子如何进入循环,如何被靶细胞摄取发挥作用的具体机制尚不明确。细胞微囊泡,是指细胞释放到胞外,大小不一的膜性小泡,其中含有丰富的蛋白质、核酸与脂质。广泛存在于血液、尿液、腹水、支气管肺泡灌洗液、唾液及母乳等众多体液中。它能被内皮细胞、巨噬细胞、血小板甚至是肿瘤细胞分泌和摄取,从而介导细胞与细胞、组织与组织间的信号通讯。依据微囊泡的大小与产生机制不同可以分为外泌体(Exosome,直径30-100nm)、微粒(Microvesic1e,100-1 000nm)、凋亡小体(Apoptosis body,1-5μm)等。其中Exosome的作用研究最为深入,已有研究发现Exosome涉及抗肿瘤免疫、肿瘤逃逸、组织修复、神经细胞间通信、病原体免疫、胚胎发育与表观遗传调控等多种生命与疾病过程。新近的研究发现Exosome在心血管稳态中具有重要的作用,研究发现脂肪组织内的脂肪细胞可以主动分泌Exosome(脂肪组织来源Exosome,adipose derived Exosome,ADE),ADE不仅参与巨噬细胞激活、介导组织纤维化、帮助组织修复,还参与炎症过程。但是糖尿病状态下发生炎症的脂肪组织释放的ADE的具体成分是什么?主要功能是什么?参与哪些生命与疾病过程?这些问题尚不清楚。为探索上述问题,我们提取了正常小鼠、肥胖型糖尿病小鼠(ob/ob小鼠)与非肥胖型糖尿病小鼠(STZ+高脂喂养诱导)的脂肪组织分泌的ADE,以及临床糖尿病与非糖尿病患者的ADE,运用多种手段检测其Exosome表征与理化特征,质谱分析糖尿病小鼠ADE的蛋白组成,运用生物信息学的方法分析其蛋白功能与参与的生命过程,为进一步探索糖尿病状态下脂肪组织分泌的ADE与心血管疾病的关系打下基础。2研究目的1)探讨分离纯化ADE的方法与策略;2)分析糖尿病来源ADE的蛋白质构成;3)运用生物信息学的方法分析ADE蛋白的功能。3实验方法1)收集糖尿病与非糖尿病小鼠及人的内脏脂肪组织分泌的上清;2)采用差速离心法、密度梯度超速离心法(重水蔗糖垫法)与沉降剂(ExoQuick)方法分离纯化ADE;3)通过检测标志蛋白、标志酶、总蛋白、动态光散射与电镜形态测定上述分离纯化方法的得率与纯度;4)使用质谱分析检测ADE中蛋白成分;5)比对数据库,分析ADE中Exosome标志蛋白的组成与脂肪因子富集情况;6)使用生物信息学方法分析ADE中蛋白功能;7)Western blotting与ELISA的方法比较非糖尿病与糖尿病个体ADE中富集的脂肪因子,并统计相关的临床影响因素;8)免疫金标及组分Western blotting分析ADE中脂肪因子的空间定位。4实验结果1)ADE分离与纯化方法的比较(1)得率比较:比较差速离心法、重水蔗糖垫法与沉降剂Exoquick法分离提纯的Exosome,结果显示差速离心法获得最多的总蛋白、Exosome标志蛋白CD63与标志酶Acetyl-CoA,沉降剂Exoquick法次之,重水蔗糖垫法相对最少;(2)纯度比较:以标志酶Acetyl-CoA与总蛋白比率作为纯度参数比较不同方法提取纯化的ADE,结果显示差速离心法获得的ADE纯度最高;同时透射电镜观察纯化的ADE样品,发现差速离心法获得的ADE背景较低,而沉降剂法获得的ADE背景中有中高电子密度的颗粒物污染;(3)粒径大小比较:差速离心法得到Exosome直径在30-100nm之间,各个批次之间直径差异较小;重水蔗糖垫法得到的Exosome直径多为30-120nm,但有部分批次的样品存在100-400nm的颗粒;沉降剂Exoquick法得到15-130nm的Exosome,但是各批次的直径差异较大;(4)孵育时间对脂肪细胞释放ADE数量的影响:比较孵育脂肪组织15rnin、30min、60min,2h,3h与6h后差速离心法分离提取的ADE,结果显示孵育6h能稳定获得最多的总蛋白、Exosome标志蛋白CD63与标志酶Acetyl-CoA;(5)孵育时间对脂肪细胞释放ADE纯度的影响:结果显示孵育6h获得的ADE中Acetyl-CoA 与总蛋白比率与孵育 15min、30nin、60min,2h,3h 得到 ADE 无显著差异;2)糖尿病ADE蛋白成分的分析(1)糖尿病ADE蛋白质谱结果:获得34901个肽段,比对数据库,阈值设定为p0.00575,ADE中鉴定出1331种蛋白;比对Exosome特征蛋白数据库ExoCarta—Top 100 protein,ADE 中含有 87 种 Exosome 特征蛋白,仅未检测到 VCP,HSPA5,SLC3A2,CCT2,TUBA1B,ANXA6,TUBA1C,TFRC,HIST2H4A,ITGA6,HIST1H4B,YWHAH等13个曾报道过的特征蛋白;(2)糖尿病ADE蛋白中脂肪因子的种类:ADE中鉴定到Dipeptidyl peptidase 4,Retinol-binding protein,Resisitin,Pigment epithelium derived factor,Adiponectin五种脂肪因子,其中DPP4肽段匹配最多,总匹配数位49,重点匹配为23。(3)糖尿病ADE蛋白功能聚类:使用David对鉴定的蛋白进行功能聚类,结果显示 ADE 中的蛋白主要功能为 Tricarboxylic acid cycle,Proteasome core complex,GTP binding,Oxidoreductase activity,Annexin,Contractile fiber,Protein import into nucleus,Regulation of T cell mediated cytotoxicity,Neutral lipid metabolic process,Nucleoside binding,Positive regulation of adaptive immune response,Glycogen metabolic process,Mitochondrial respiratory chain complex I,Nicotinamide nucleotide metabolic process,Lipoic acid binding,ATP synthesis coupled proton transport(P0.007)。(4)糖尿病ADE蛋白Pathway聚类:主要涉及蛋白结合、核酸结合与钙离子通道等功能。(5)非糖尿病与糖尿病的小鼠(WTvs.ob/ob和WTvs.STZ-WT),人(无vs.合并糖尿病的患者)的内脏脂肪ADE中DPP4含量比较:与WT小鼠相比,ob/ob小鼠的ADE中DPP4明显升高。为了明确DPP4在其他糖尿病小鼠模型ADE中的表达情况,排除瘦素基因的影响,我们构建了 STZ诱导的糖尿病小鼠模型。与WT小鼠相比,STZ诱导的WT小鼠ADE中DPP4同样明显升高。(6)为了探索其临床相关性,我们收集了 19例人体大网膜内脏脂肪组织(9例糖尿病,10例正常对照),使用上述方法分离纯化得到人源ADE。ELISA结果显示糖尿病患者ADE中DPP4明显高于正常对照。(7)ADE中DPP4与脂肪细胞大小,空腹血糖的关系:为探索影响ADE中DPP4含量的临床因素,我们采集了上述19例研究对象的临床及实验室检查资料,其中脂肪细胞大小(r=0.60,P0.01),空腹血糖(r=0.50,p0.01)与ADE中DPP4的含量成正相关关系。而ADE中DPP4含量与性别、年龄、体重、吸烟史、饮酒史、冠心病史、高血压史、糖尿病史、糖尿病病程、TC、TG、HDL-C和LDL-C无明显线性关系。(8)糖尿病ADE膜组分与内含物组分中DPP4含量比较:DPP4可裂解为胞内-跨膜段与胞外段两部分。胞外段为DPP4可溶的形式,可以直接释放到体液中,为明确ADE中DPP4的具体存在形式,我们联合碱与超声方法破碎ADE,并分离ADE膜组分与内含物组分,Western blotting检测两者中DPP4含量。结果显示内含物组分中不含DPP4。(9)糖尿病ADE DPP4原位金标电镜观察:为了在原位显示DPP4在ADE的表达,我们使用免疫金标ob/ob ADE,电镜结果显示,对照ADE无金颗粒结合,而DPP4抗体标记组的ADE膜表面有明显的金颗粒结合。5结论1)差速离心法是稳定获得高纯度与高得率ADE的合适方法;2)糖尿病ADE中富集DPP4等脂肪因子,其含量与空腹血糖水平和脂肪细胞大小成正相关关系;3)糖尿病ADE负载的蛋白可能参与能量代谢、物质合成、免疫调节等多种生物学过程。1研究背景众多的心血管疾病危险因素中,糖尿病可以独立增加心血管疾病风险4倍。糖尿病是以血糖升高为主要特征的慢性代谢性疾病,为此众多学者开展了许多临床试验,观察降糖治疗是否能有效降低糖尿病患者的心血管疾病风险,但是这些临床试验的结果仍存在巨大争议。减少糖尿病患者的心血管事件,最直接有效的治疗方法是心脏的再血管化。但是,无论是微创的经皮冠状动脉介入术还是开胸的冠状动脉旁路移植术,都面临术后再狭窄的严峻挑战。血管再狭窄最主要的病理表现是原有内皮损伤后血管平滑肌细胞在病理刺激下异常增殖并迁移至内膜下形成新生内膜,导致内膜肥厚,影响血流灌注形成再狭窄。药物涂层支架表面的雷帕霉素及紫杉醇等抑制增殖的药物在可以有效抑制平滑肌细胞增殖与迁移。药物涂层支架的广泛应用似乎为预防糖尿病术后再狭窄带来了曙光。遗憾的是,新的临床数据显示,即便是应用了药物涂层支架,糖尿病仍然是术后再狭窄最重要的独立危险因素。因此,深入研究糖尿病患者血管再狭窄及内膜新生的发生机制和干预靶点,对于改善糖尿病患者心血管预后具有重要的理论和实际意义。近年来的研究结果表明糖尿病状态下脂肪组织存在不断进展的慢性炎症,并不断向周围与血液中分泌具有炎性作用的脂肪因子。有学者认为心血管疾病与2型糖尿病同属于慢性的、亚临床的炎症性疾病。血液循环中具有炎性作用的脂肪因子与糖尿病患者术后再狭窄发生率密切相关。但是近年来的针对脂肪因子的治疗似乎都未取得预期的效果。所以,开发阻断脂肪因子产生、运输和结合的治疗措施对于防治糖尿病患者术后再狭窄有着重要意义。有学者发现脂肪组织分泌的Exosome样囊性小泡能携带脂肪因子,介导巨噬细胞激活,促进炎症并导致胰岛素抵抗。Exosome是一种细胞分泌至胞外的,大小不一的膜性小囊泡(直径30-100nm)。Exosome内的蛋白或核酸成分参与细胞间、细胞内信号传导,介导表观遗传学调控、代谢记忆、血管新生、脂质代谢与免疫等过程。但是脂肪组织来源的Exosome(Adipose derived Exosome,ADE)在内膜新生与血管再狭窄中的作用及其对血管平滑肌增殖与迁移能力的影响尚未见报道。二肽基肽酶4(DPP4),是一种新发现的脂肪因子,可以以旁分泌与自分泌的形式参与胰岛素抵抗的发生。因为存在可溶性的DPP4,在血浆和其他体液中都可以检测到DPP4的活性。DPP4的抑制剂常与二甲双胍联用作为2型糖尿病的二线治疗。我们在论文I中的研究发现糖尿病个体内ADE富含DPP4分子,但是对于ADE中DPP4对糖尿病患者内膜新生中的作用及机制还不清楚。2研究目的:1)探索糖尿病来源ADE对血管内膜新生的作用;2)明确ADE中DPP4分子对血管平滑肌细胞增殖与迁移功能,以及血管内膜新生的作用;3)探索ADE对血管内膜新生的具体分子机制。3研究方法:1)实验模型构建:小鼠颈动脉内膜拉伤构建血管内膜新生模型;2)细胞模型:提取各基因型小鼠的原代主动脉血管平滑肌细胞,使用3-5代细胞进行实验;3)ADE对内膜新生的作用:血管内膜新生模型小鼠尾静脉注射提取的非糖尿病与糖尿病来源的ADE;4)ADE对血管平滑肌细胞增殖与迁移的作用:加入不同来源的ADE后通过划痕实验、Transwell实验与Ki67免疫荧光观察平滑肌细胞的迁移与增殖功能;5)PKH26荧光染料标记ADE进行体内外示踪实验研究ADE在体内外的摄取情况;6)ADE中DPP4对血管内膜新生的影响:盐酸西格列汀与和艾塞那肽处理尾静脉注射糖尿病来源ADE的血管内膜新生模型小鼠,观察DPP4抑制剂与GLP1类似物对ADE刺激内膜新生的影响;7)Western blotting检测ADE刺激下小鼠内膜新生的血管中的ERK1/2、与NF-κB信号通路的变化;8)体外培养的血管平滑肌细胞中加入ERK1/2与NF-κB抑制剂,观察ERK1/2与NF-κB通路在糖尿病ADE刺激的血管内膜新生中的作用;9)IPGTT、IPITT、血脂血糖功能与基本生理指标的测定,观察ADE对小鼠糖脂代谢与基本生理功能的影响。4研究结果:1)ADE对血管损伤后内膜新生的影响(1)非糖尿病(WTADE)与糖尿病来源的ADE(ob/obADE)对血管损伤后内膜新生面积与比率的影响:与对照组相比,WTADE刺激组损伤的颈动脉管腔面积、新生内膜面积和新生的内膜/中膜厚度的差异无统计学意义,仅中膜较对照组增厚。而ob/ob ADE刺激组较对照组颈动脉管腔面积明显缩小、新生内膜面积显著扩大,新生的内膜/中膜厚度升高。(2)非糖尿病与糖尿病来源的ADE对血管损伤后新生内膜内平滑肌细胞增殖的影响:Ki67阳性占中内膜有核细胞比率近似等于新生内膜平滑肌增殖细胞比率。结果显示假手术组,对照组,WT ADE刺激组的损伤血管中增殖细胞较少,皆3%,而ob/ob ADE刺激组的损伤血管中增殖细胞较前三组明显增加(11.0±0.51%)。(3)非糖尿病与糖尿病来源的ADE对小鼠糖脂代谢等代谢指标的影响:与假手术组相比,BSA对照组,WTADE组,ob/obADE组体重,日常食物摄入,饮水摄入,收缩压,舒张压,心率,空腹血糖,空腹胰岛素,TG,TC,HDL-C,LDL-C差异无统计学意义。2)非糖尿病与糖尿病来源的ADE对原代血管平滑肌细胞增殖与迁移功能的影响:(1)原代小鼠主动脉平滑肌的鉴定:每个爬片随机选取10个视野,计算αSMA阳性细胞占总细胞数的比率。提取的各批次细胞阳性率为95.2～98.5%。(2)非糖尿病与糖尿病来源的ADE对原代血管平滑肌细胞增殖功能的影响:Ki67阳性细胞数占总细胞数近似等于血管平滑肌细胞增殖率。对照组(5.6±0.4%)、BSA 组(5.1±0.12%)与 WT ADE(6.0±0.35%)组三组的增殖细胞阳性率差异无统计学意义,而ob/ob ADE刺激组增殖细胞阳性率较前三组明显升高(15.3±4.2%)。(3)非糖尿病与糖尿病来源的ADE对原代血管平滑肌细胞迁移功能的影响:在Scratch wound实验中,与BSA组相比,WT ADE刺激下的平滑肌迁移率并无明显变化,而ob/ob ADE刺激后平滑肌迁移率明显提高。Transwell实验的结果显示与其他三组相比ob/ob ADE刺激后迁移至下室的平滑肌数量明显增多。3)盐酸西格列汀与和艾塞那肽对ob/ob ADE诱发的内膜新生的影响(1)盐酸西格列汀与和艾塞那肽对ob/ob ADE诱发的内膜新生面积与比率影响:在体内实验中,内膜损伤并按上述方法注射ob/ob ADE刺激的小鼠给予盐酸西格列汀与和艾塞那肽处理,结果显示盐酸西格列汀与载体组相比能显著减少新生内膜/中膜比率。而艾塞那肽处理与载体组相比,新生内膜/中膜比率差异无统计学意义。(2)盐酸西格列汀与和艾塞那肽对ob/ob ADE诱发的新生内膜中平滑肌增殖的影响:在体内实验中,盐酸西格列汀能显著降低ob/ob ADE处理下的平滑肌增殖率。而艾塞那肽处理与载体组相比,平滑肌增殖比率无明显差异。(3)盐酸西格列汀与和艾塞那肽对ob/ob ADE处理小鼠胰岛素敏感性的影响:在IPGTT与IPITT实验中,艾塞那肽明显提高了 ob/ob ADE处理小鼠胰岛素敏感性。但未观察到盐酸西格列汀对ob/ob ADE处理小鼠胰岛素敏感性有明显影响。(4)盐酸西格列汀与和艾塞那肽对ob/ob ADE刺激的血管平滑肌细胞增殖功能影响:在体外实验中,盐酸西格列汀能显著降低ob/ob ADE处理下的平滑肌增殖率。而艾塞那肽处理与载体组相比,平滑肌增殖比率无明显差异。(5)盐酸西格列汀与和艾塞那肽对ob/ob ADE刺激的血管平滑肌细胞迁移功能的影响:在Scratch wound实验中,与载体组相比,艾塞那肽对ob/ob ADE刺激下的平滑肌迁移率并无明显影响,而盐酸西格列汀能明显降低ob/ob ADE刺激下平滑肌迁移率。Transwell实验的结果显示艾塞那肽对ob/ob ADE刺激下的下室迁移的平滑肌数目并无明显影响,而盐酸西格列汀组明显减少ob/ob ADE刺激下迁移至下室的平滑肌数量。4)TLR4-ERK1/2/NF-KB信号通路在ADE诱导的内膜新生及平滑肌细胞增殖与迁移中作用(1)ADE对新生内膜中ERK1/2/NF-κB信号通路的影响我们使用了 Western blotting检测了 WT ADE与ob/ob ADE刺激的损伤的右侧颈动脉中蛋白p65(Ser536位点)与ERK1/2(Thr202/Tyr204位点)的磷酸化情况,结果证明ob/ob ADE刺激下血管中p65(Ser536位点)与ERK1/2(Thr202/Tyr204位点)磷酸化较WT ADE刺激组明显升高。(2)TLR4在ADE诱导的内膜新生的作用TLR4是ERK1/2/NF-κB信号通路的共同上游,也是最关键的模式受体之一。有文献报道TLR4对于Exosome的内化及信号传导具有关键作用。于是我们使用TLR4 KO小鼠探讨其在ob/ob ADE刺激的内膜新生中的作用,结果显示与WT小鼠相比较,TLR4 KO能显著降低内膜增生的比率与增殖细胞比率。(3)P65磷酸化抑制剂Caffeic acid phenethyl ester对ob/ob ADE培养的原代血管平滑肌细胞增殖与迁移功能的影响Caffeic acid phenethyl ester是常用的P65磷酸化抑制剂,经过我们实验验证,Caffeic acid phenethyl ester在150μM的浓度的时候就能达到明显的抑制效果。此浓度下,Caffeic acid phenethyl ester能明显减少ob/ob ADE刺激下的平滑肌细胞增殖与迁移。(4)ERK1/2磷酸化抑制剂FR180604对ob/ob ADE培养的原代血管平滑肌细胞增殖与迁移功能的影响ERK1/2磷酸化抑制剂FR180604在10μM浓度下能明显抑制ERK1/2 Thr202/Tyr204位点磷酸化,且能明显减少ob/ob ADE刺激下的平滑肌细胞增殖。Scratch wound实验与Transwell实验也明确10μM的FR180604降低ob/ob ADE刺激下的平滑肌细胞的迁移能力。5研究结论1)糖尿病ADE中含有更多的DPP4,可通过TLR4-NF-κB/ERK1/2途径显著增强血管平滑肌细胞增殖与迁移能力,加剧血管内膜新生;2)DPP4抑制剂等降糖药能显著减缓糖尿病ADE加剧的血管内膜新生,GLP1类似物无显著作用;3)联系炎症脂肪与受损血管的ADE可能成为治疗糖尿病心血管病变的新靶点。1研究背景糖尿病大血管病变是糖尿病严重并发症——冠心病、脑卒中及周围血管疾病的共同病理基础。脂肪组织作为重要的内分泌与旁分泌器官影响糖尿病及其大血管并发症。近来的研究发现与血管位置最为接近的管周脂肪(Perivascular adipose tissue,PVAT)与动脉粥样硬化等糖尿病大血管并发症关系密切。Framingham和Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis研究发现心外膜PVAT的体积是心血管与动脉粥样硬化疾病的独立危险因素。所以有学者提出PVAT体积增加代表的血管"局部肥胖"可能与糖尿病或代谢综合征相关的动脉粥样硬化疾病联系更为密切。随后的研究证实了"局部肥胖"的PVAT出现脂肪局部炎症与脂肪因子的增多。并且这些局部脂肪因子的变化相对循环中各种血浆生物标志物更能反映冠脉疾病严重程度。但是PVAT在糖尿病中如何发生"局部肥胖",这些脂肪因子是如何产生并穿越血管壁影响血管结构与功能的机制仍然不清楚。巨噬细胞极化是脂肪炎症的关键环节,在代谢紊乱的糖尿病患者脂肪组织中,极化的巨噬细胞使得脂肪细胞功能发生障碍,而功能障碍的脂肪细胞释放出来的炎症介质进一步趋化或激活巨噬细胞,脂肪细胞与巨噬细胞相互作用引发炎症反应的恶性循环。未活化的巨噬细胞一般称为M0型巨噬细胞,而活化的巨噬细胞大体上可以分为两种亚型,Ml型巨噬细胞具有分泌大量促炎细胞因子的功能;M2型巨噬细胞分泌包括IL-10等抑制炎症的细胞因子,M1/M2巨噬细胞失衡是诱导脂肪组织炎症的主要因素。过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptors γγ,PPARγ)是调节脂肪重构与巨噬细胞极化的重要转录因子。PPARy可以通过激活转录多种基因参与调解脂肪细胞与巨噬细胞功能。临床研究也发现服用PPARγ激活剂——噻唑烷二酮类药物的糖尿病患者内脏脂肪组织中M2细胞数目上升,M1/M2比率降低。但是管周脂肪及其中的巨噬细胞的变化与PPARγ的调控机制仍不清楚。TRB3是糖尿病糖脂代谢与巨噬细胞功能重要的调节蛋白,之前的研究发现TRB3参与糖尿病中巨噬细胞的凋亡,在TRB3基因沉默后,斑块内的巨噬细胞凋亡减少,炎症因子表达减少。同时也有研究发现TRB3参与调解糖尿病脂肪细胞的功能紊乱,过表达TRB3可以显著抑制PPARγ的转录活性。但是TRB3/PPARγ途径在巨噬细胞与脂肪炎症方面在作用尚未见报道。综合上述研究,"局部肥胖"的PVAT发生炎症,巨噬细胞极化是脂肪炎症的关键因素,并且与糖尿病动脉粥样硬化密切相关。TRB3基因在糖尿病疾病中表达显著升高,并且与PVAT炎症中两种重要细胞——脂肪细胞和巨噬细胞功能调控密切相关。其下游PPARy可能参与调节脂肪功能与巨噬细胞炎症。但是糖尿病中PVAT的巨噬细胞极化的机制尚不明确,TRB3/PPARγ通路在管周脂肪脂肪炎症中的作用仍不清楚。为探索上述问题,我们建立了糖尿病小鼠颈动脉周围脂肪移植模型,通过极化的巨噬细胞过继免疫糖尿病小鼠,局部沉默TRB3基因、PPARy激动剂干预的方法研究TRB3/PPARγ途径在PVAT巨噬细胞极化和动脉粥样硬化斑块过程中的作用及机制,为进一步探索糖尿病状态下管周脂肪与相关血管病变的关系奠定基础。2研究目的1)通过建立糖尿病管周脂肪移植模型,探讨糖尿病状态下管周脂肪炎症与动脉粥样硬化斑块的关系;2)通过体外诱导极化的巨噬细胞过继免疫糖尿病动脉粥样硬化模型小鼠,明确巨噬细胞极化对管周脂肪炎症与斑块易损性的影响;3)通过给予PPARγ激活剂和管周脂肪局部沉默TRB3,明确TRB3-PPARγ通路在巨噬细胞极化介导的管周脂肪炎症与斑块形成中的作用。3研究方法1)在糖尿病动脉粥样硬化模型小鼠的基础上构建颈动脉管周脂肪移植模型;2)检测颈动脉管周脂肪移植对整体糖脂代谢、胰岛素抵抗、脂肪含量与能量代谢的影响;3)超声与病理方法检测管周脂肪移植后颈动脉动脉粥样硬化形成与血管重构情况;4)体外诱导极化的巨噬细胞过继免疫糖尿病管周脂肪移植小鼠,检测管周脂肪巨噬细胞炎症情况及动脉粥样硬化斑块负荷与易损性;5)给予模型小鼠PPARγ激动剂吡格列酮处理,检测管周脂肪巨噬细胞炎症情况及动脉粥样硬化斑块负荷与易损性;6)超声引导下管周脂肪局部注射TRB3-shRNA病毒载体,检测管周脂肪巨噬细胞炎症情况及动脉粥样硬化斑块负荷与易损性。4研究结果1)糖尿病管周脂肪移植模型的建立:移植后的管周脂肪无液化坏死,内部存在新生血管与神经纤维标志物;2)管周脂肪移植对对照饮食和糖尿病小鼠的整体糖脂代谢、整体脂肪含量与整体代谢率无显著影响;3)管周脂肪移植不增加对照饮食小鼠颈动脉斑块负荷,但在糖尿病小鼠中,管周脂肪随病程进展增加颈动脉斑块负荷与血管重构指标(中内膜厚度IMT与脉搏波传播速度PWV);4)糖尿病颈动脉管周脂肪移植增加颈动脉斑块负荷与易损性,并且加重管周脂肪炎症与Ml细胞极化;5)体外诱导极化的Ml巨噬细胞过继免疫糖尿病管周脂肪移植小鼠,增加颈动脉斑块负荷与易损性,并且加重管周脂肪炎症与Ml细胞极化、M2巨噬细胞过继免疫则减轻颈动脉斑块负荷与易损性,抑制管周脂肪炎症,升高M2细胞的比率;6)PPARy激动剂吡格列酮处理糖尿病小鼠,在减轻整体斑块负荷的同时,可以显著减轻管周脂肪移植加重的颈动脉斑块负荷与易损性,并且抑制管周脂肪炎症,升高M2巨噬细胞比率;7)局部抑制管周脂肪TRB3的表达可以减轻管周脂肪移植加重的颈动脉斑块负荷与易损性,缓解管周脂肪炎症,促进巨噬细胞向M2方向转化;8)免疫共沉淀实验证实TRB3与PPARγ存在蛋白质相互作用。5研究结论1)糖尿病下管周脂肪内TRB3表达升高,负性调控PPARy活性;2)糖尿病促进管周脂肪内巨噬细胞向Ml方向极化,加重管周脂肪与相邻血管内炎症;3)TRB3沉默与PPARγ激动剂能显著抑制Ml巨噬细胞极化介导的管周脂肪炎症,减轻斑块负荷并稳定斑块。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R54
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本文编号：1919224