子宫内膜干细胞生物蛋白制剂对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

发布时间：2018-05-24 13:46

  本文选题：子宫内膜干细胞 + 细胞凋亡　； 参考：《贵州医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:阐明子宫内膜干细胞(endometrial stem cells,EnSCs)来源细胞因子“鸡尾酒”(EnSCs derived cytokine cocktail,EdCC)的心肌保护效应与MEK/ERK信号通路的关系。方法:用人的EnSCs于37℃、5%CO2培养箱中培养,24h后更换培养液,以后每3d换液,生长融合达70%左右时进行传代培养,培养至第三代,用流式细胞术鉴定EnSCs表达间充质干细胞表面标志物,然后通过Millipore技术从培养的EnSCs上清液中获得EdCC,蛋白定量后供实验用或-80℃冰箱储存。用ELISA检测EnSCs原培养液中EGF,以结扎冠状动脉前降支的方式制备心肌缺血再灌注损伤模型。根据实验需要通过小鼠尾静脉注射不同剂量或不同冻存时间的EdCC及相应对照组试剂,再灌注24小时后用TTC/Evans blue染色小鼠I/R心肌,用image pro软件计算其梗死面积。以7um厚度冰冻切片留样,采用TUNEL染色和免疫荧光染色方法检测其细胞凋亡情况,用Western blot检测ERK1/2磷酸化水平和cleaved caspase-3表达。乳小鼠心肌细胞分为正常组、对照组和EdCC组,用过氧化氢(H2O2)造成氧化应激,检测上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性,同样用TUNEL染色检测细胞凋亡,DCFH-DA检测细胞内活性氧族(ROS)浓度。结果:1、体外培养的EnSCs贴壁生长,呈纺锤形,融合后形成旋涡样结构。经流式细胞学分析,EnSCs表达间充质干细胞表面标志CD90,不表达CD34和CD45造血细胞来源表面标志;用Millipore蛋白超滤技术可截留近90%EnSCs上清液中的EGF蛋白;2、每15ml EnSCs上清液经Millipore超滤技术超滤浓缩后的体积为(200.5±11.2)μl,蛋白浓度为(5.57±0.95)μg/μl,EdCC的提取效率为每24h(222.4±29.3)μg/106细胞。3、-80℃长期储存可导致EdCC蛋白浓度及总量逐渐降低;4、EdCC可以保护乳小鼠心肌细胞氧化应激所致细胞损伤及凋亡;5、EdCC减轻小鼠缺血再灌注损伤注射100μg为最佳剂量;5、-80℃长时间储存降低EdCC心肌保护效应;6、EdCC可促进心肌ERK1/2磷酸化;7、EdCC介导的ERK1/2磷酸化可被PD98059阻断;8、EdCC通过MEK1-ERK信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤;9、EdCC通过MEK1-ERK信号通路抑制细胞凋亡10、EGFR部分参与EdCC的心肌保护作用。结论:1、从培养人的EnSCs上清液中成功制备了可供直接使用的EdCC;2、该研究结果对目前成体干细胞治疗模式从细胞转移到细胞因子具有重要的理论意义;3、从组织坏死、细胞凋亡和凋亡蛋白表达三个方面验证了EdCC对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。
[Abstract]:Aim: to elucidate the relationship between myocardial protective effect of endometrial stem cells (stem cells) derived from endometrial stem cell (endometrial stem cell) and MEK/ERK signaling pathway. Methods: human EnSCs was cultured at 37 鈩，

本文编号：1929271