运动上调Neuregulin1表达促进心梗心脏修复和抑制骨骼肌萎缩的机制探讨

发布时间：2018-05-26 02:00

  本文选题：持续有氧运动 + 抗阻训练　； 参考：《陕西师范大学》2016年博士论文

【摘要】：心肌梗死(心梗,myocardial infarction,MI)是世界范围内危害人类健康的重大疾病。心梗导致其梗死区微环境发生改变,大量心肌细胞死亡,发生心肌替代性纤维化,严重损害心功能,同时伴随骨骼肌萎缩现象,影响患者的生存、运动能力和生活质量。运动训练可有效改善心梗后心功能,抑制骨骼肌萎缩。但不同运动强度和运动方式对心梗心功能和骨骼肌萎缩的影响及其可能机制尚缺乏系统研究。运动可诱导心脏生理性肥大并伴有心肌细胞增殖现象,上调心脏神经调节蛋白(Neuregulin1,NRG1)等多种生长因子表达。NRG1在心脏和骨骼肌发育及心脏损伤保护中发挥重要作用。运动是否可促进心梗心肌细胞增殖,其机制是否与上调NRG1表达有关尚无文献报道。NRG1是否通过调节心脏发育相关基因表达,维持心肌细胞结构和功能,是否可改善心梗后骨骼肌萎缩,运动上调心梗后NRG1表达改善骨骼肌萎缩的可能机制仍需实验探讨。研究目的:采用大鼠心梗模型,探讨不同运动方式对心梗后心功能和骨骼肌萎缩的影响,筛选安全有效的运动康复方式;探讨运动是否上调心肌NRG1蛋白表达,促进心肌细胞增殖和心梗心脏修复;建立斑马鱼转基因模型,探讨NRG1对正常心脏和缺损心脏修复的影响及可能机制;探讨外源性NRG1干预是否抑制心梗诱导的骨骼肌萎缩;探讨运动上调NRG1表达促进心梗心脏修复和抑制骨骼肌萎缩的机制。研究方法:1.实验大鼠分组:3月龄雄性Sprague Dawley大鼠,体重180～220g,建立心梗模型或假手术模型,进行运动训练或药物干预。第二章将术后存活大鼠分为假手术对照组(Sham组)、心梗组(MI组)、心梗抗阻训练组(MR组)、心梗间歇有氧运动组(MA组)和心梗持续有氧运动组(ME组),每组6～8只;第三章大鼠分为假手术组(Sham)、心肌梗死组(Sed-MI,同MI组)、心梗+有氧运动组(Ex-MI,同ME组)、心梗+有氧运动+生理盐水组(Ex-MI-S)和心梗+有氧运动+AG1478组(Ex-MI-AG)。第四章大鼠分为:假手术组(Sham)、心梗组(MI)、心梗+抗阻训练组(MR)、假手术组+生理盐水组(S-S)、心梗+生理盐水组(MI-S)和心梗+rhNRG1组(MI-NRG1)。2.大鼠模型制备:结扎大鼠心脏左冠状动脉前降支建立心梗模型。运动组大鼠于手术后1wk开始进行训练,5d/wk,共4wk。抗阻训练采用爬梯训练。间歇有氧运动和持续有氧运动采用不同方案跑台训练。Ex-MI-AG组大鼠于术后1wk腹腔注射ErbB抑制剂AG1478,注射剂量为1mg/kg体重,隔天注射,共注射4wk。MI-NRG1组大鼠于手术后1wk骨骼肌注射重组人NRG1蛋白(rhNRG1),注射剂量为15μg/kg体重,注射部位为小腿后侧肌群,隔天注射,共注射3wk。3.大鼠心脏检测指标:血流动力学检测心功能;组织学染色检测心室结构;Western Blot检测心肌组织中NRG1、ErbB受体、PI3K/Akt信号通路、GATA4、Nkx2.5、Bcl-2和Bax蛋白表达情况;免疫组化或荧光免疫组化检测心肌组织细胞增殖相关蛋白PCNA、BrdU和c-kit以及血管新生相关蛋白α-SMA、CD105表达水平;DHE染色检测心肌组织ROS水平。4.大鼠骨骼肌检测指标:HE染色检测肌组织形态变化;DHE染色检测骨骼肌组织ROS水平;检测肌组织抗氧化酶SOD和GSH-Px活性;荧光免疫组化检测骨骼肌中 ErbB2 和 ErbB4 表达水平;Western Blot 检测 IGF-1、MGF、MSTN、NRG1、PI3K、pPI3K、Akt、pAkt、Smyd1、MuRF1、Hsp90α 蛋白表达。5.斑马鱼心脏研究实验方法:采用Cre-Loxp系统构建心脏特异性NRG1蛋白过表达斑马鱼模型cmlc2:CreER;β-act2:BSNrg1。HE染色检测心脏结构;荧光免疫组化检测心脏中PCNA表达水平;RT-PCR检测心肌组织中gata4、nkx2.5、tbx5、smyd1b、hsp90a和murf mRNA 表达变化。6.斑马鱼骨骼肌研究实验方法:杂交smyd1b杂合子突变体(smyd1b+/-),得到smyd1b纯合子突变体(smyd1b-/-)。CRISPR/Cas9技术敲除野生型斑马鱼中smyd1b基因和Myomesin3-RFP转基因斑马鱼中hsp90α基因。F59染色检测斑马鱼慢肌纤维结构,myomesin染色检测斑马鱼快肌纤维结构。研究结果:1不同运动方式对心梗大鼠心功能、心脏组织结构和骨骼肌萎缩的影响存在差异(1)抗阻训练、间歇和持续有氧运动均可不同程度改善心梗后的心功能,降低心肌纤维化程度。间歇和持续有氧运动效果优于抗阻训练。4wk运动干预后,MI、MR、MA和ME组大鼠存活率分别为90%、100%、70%和100%。心梗导致心功能恶化,不同运动方式均改善心功能;且持续有氧运动和间歇有氧运动效果优于抗阻训练。MI组心肌细胞大量坏死,胶原纤维恶性增生,胶原容积百分比(collagen volume fraction,CVF)显著增加(P0.01);MA 和 ME组梗死区,CVF值显著下降损伤程度较MI组减少(P0.01)。(2)抗阻和间歇有氧运动改善心梗大鼠骨骼肌萎缩效果优于持续有氧运动。与Sham组比较,MI组比目鱼肌相对质量(肌肉重量/体重)显著下降(P0.05),细胞横截面积显著缩小(P0.05),CS活性显著下降(P0.05),腓肠肌相对质量和细胞横截面积变化无显著差异;4wk运动干预后,MA、MR和ME组骨骼肌CS活性升高(P0.05),比目鱼肌和腓肠肌相对质量和细胞横截面积均显著增加(P0.05,P0.01),且MR组和MA组效果优于ME组。不同运动方式对心梗大鼠心功能、心脏组织结构和骨骼肌萎缩的影响存在差异。MA组和ME组对改善心脏功能和心肌纤维化的效果优于MR组。MA组和MR组对改善骨骼肌萎缩后的生长效果优于ME组。对此,选取持续有氧运动研究运动对损伤心脏修复的机制,选取抗阻训练研究运动改善骨骼肌萎缩的机制。2持续有氧运动上调心梗大鼠心肌NRG1表达,促进心肌细胞增殖和心脏修复(1)持续有氧运动激活心梗大鼠心肌NRG1/ErbB信号通路,改善心梗心脏的病理性重塑和心功能。与Sham组比较,心梗导致PI3K磷酸化水平降低(Tyr467,P0.05);与Sed-MI组比较,持续有氧运动上调NRG1表达(P0.05)和ErbB2(Tyr1248,P0.01)、ErbB4(Y1284,P0.01)、PI3K(P0.01)和 Akt(Thr308,P0.05)磷酸化水平。Masson 染色和心功能测定结果证实,心梗导致心功能下降,心肌组织重塑,持续有氧运动可有效改善心功能,降低纤维化水平。给予ErbB信号抑制剂AG1478,显著降低心梗大鼠持续有氧运动干预的效应。(2)持续有氧运动促进心梗心脏的心肌细胞增殖。与Sham组比较,Sed-MI组BrdU+心肌细胞显著增加(P0.05);与Sed-MI组比较,持续有氧运动显著增加BrdU+心肌细胞、PCNA+心肌细胞和c-kit+细胞数量(P0.01),上调GATA4和Nkx2.5蛋白表达水平(P0.05)。给予AG1478,显著降低心梗大鼠持续有氧运动干预的效应。(3)持续有氧运动降低心梗大鼠心肌细胞凋亡,ROS水平和MuRF1蛋白表达。与Sham组比较,心梗导致大鼠心肌Bax/Bcl-2比值升高(P0.01),TUNEL+细胞数量显著增加(P0.01);持续有氧运动显著降低心梗心肌Bax/Bcl-2比值和TUNEL+细胞数量(P0.01)。给予AG1478,降低了心梗大鼠持续有氧运动干预的效应。与Sham组比较,心梗大鼠心肌ROS水平和MuRF1蛋白表达显著升高(P0.01),持续有氧运动干预后显著降低心肌ROS水平和MuRF1蛋白表达(P0.05)。3心脏特异NRG1过表达诱导正常心脏肥大和心肌细胞增殖,促进损伤心脏修复(1)心脏特异性NRG1过表达诱导正常斑马鱼心脏肥大。与对照组比较,诱导转基因斑马鱼NRG1蛋白过表达3个月后,斑马鱼体重显著降低(P0.01),心脏异常增大,心脏横截面积和室壁厚度显著增加(P0.01)。正常斑马鱼心脏存在PCNA+心肌细胞。与对照组比较,NRG1过表达3个月后导致PCNA+心肌细胞数量显著增加(P0.01)。(2)心脏特异性过表达NRG1调节心脏发育相关基因表达。与对照组比较,NRG1过表达斑马鱼心肌gata4、nkx2.5和tbx5mRNA表达显著增加(P0.05),smyd1b、hsp901和hsp90α2 mRNA表达显著上调(P0.05),murf1a和murf1b mRNA表达显著降低(P0.05,P0.01),murf2a和murf2b mRNA表达无显著差异。(3)斑马鱼缺损心脏的心肌细胞增殖和nrg1基因表达时间窗相似。野生型斑马鱼心尖切除术后发现,斑马鱼心脏切除后可再生,且在第7d时为PCNA表达高峰。与损伤后第1d比较,损伤第7dnrg1 mRNA表达显著升高(P0.05),与第7d比较,第14d心肌nrg1 mRNA表达显著下降(P0.05)。(4)心脏特异性NRG1过表达促进斑马鱼缺损心脏修复再生。损伤后第7d,心脏特异性NRG1过表达斑马鱼较野生型斑马鱼的心脏缺损后修复完整,室壁变厚(P0.05)。第4d时,心脏特异性NRG1过表达斑马鱼较野生型斑马鱼缺损心脏的PCNA表达水平显著增加(P0.05),第7d其表达下降(P0.05)。提示,NRG1过表达加速了缺损心脏的修复过程。野生型心脏缺损斑马鱼在损伤7d后,心脏gata4、nkx2.5、tbx5和smyd1b表达差异不显著,hsp90a2表达显著降低(P0.05)。心脏特异性NRG1过表达的缺损心脏斑马鱼,心脏gata4和nkx2.5表达无显著差异,tbx5、smyd1b和hsp90a2表达显著增加(P0.05)。4骨骼肌外源性注射rhNRG1可改善心梗大鼠骨骼肌萎缩和心功能(1)外源性rhNRG1干预显著改善心梗大鼠骨骼肌萎缩。与S-S组比较,MI-S组大鼠比目鱼肌相对质量下降(P0.05),肌细胞横截面积缩小(P0.05);与MI-S组比较,外源性rhNRG1干预显著增加心梗大鼠比目鱼肌相对质量(P0.05),但肌细胞横截面积变化不显著。(2)外源性rhNRG1干预显著激活心梗大鼠骨骼肌PI3K/Akt信号通路,调节心梗大鼠骨骼肌Smyd 1、MuRF 1和Hsp 90α的蛋白表达。与S-S组比较,MI-S组大鼠比目鱼肌ErbB4受体表达和PI3K磷酸化水平无显著差异,Akt磷酸化水平降低(P0.05),Smyd1蛋白表达下降(P0.05),MuRF1和Hsp90α蛋白表达显著升高(P0.01);外源性rhNRG1干预显著促进比目鱼肌ErbB4受体表达,上调PI3K和Akt磷酸化水平(P0.01),上调Smyd1蛋白表达(P0.05),抑制 MuRF1 和 Hsp90α蛋白表达(P0.05,P0.01)。(3)外源性rhNRG1干预显著改善心脏收缩功能。与S-S组比较,MI-S组大鼠LVEDP显著升高(P0.01),LVSP和±dp/dtmax显著降低(P0.01);外源性rhNRG1干预显著提高LVSP和+dp/dtmax(P0.05,P0.01),LVEDP 和-dp/dtmax 无显著差异。5敲除smyd1和hsp90α基因抑制斑马鱼骨骼肌肌小节组装Smyd1b基因敲除胚胎出生第5d时死亡。Myomesin染色发现,对照组斑马鱼快肌细胞结构清晰,肌小节完整,细胞排列整齐。smyd1b基因突变体斑马鱼骨骼肌无明显肌小节,sgRNA注射斑马鱼肌小节部分遭到破坏。F59染色发现,对照组慢肌纤维结构清晰,肌球蛋白组装正常,smyd1b突变体纯合子斑马鱼以及sgRNA注射斑马鱼的慢肌纤维在出生24h时肌小节均发生紊乱,48h时出现肌小节,但肌细胞形态异常,72h时肌细胞形态基本恢复。敲除myomesin3-RFP斑马鱼hsp90α基因。结果发现,对照组所有骨骼肌细胞表达RFP,设计的3条hsp90α-sgRNA均可抑制部分骨骼肌细胞RFP表达。hsp90α-sgRNA-1斑马鱼F59染色发现,RFP与MHC表达共定位于同一个骨骼肌细胞。6抗阻训练上调心梗大鼠骨骼肌NRG1表达及改善骨骼肌萎缩的可能机制(1)抗阻训练上调心梗大鼠骨骼肌NRG1/ErbB信号。与Sham组比较,MI组大鼠骨骼肌NRG1表达下降(P0.05),ErbB2/4表达无显著差异。与MI组比较,抗阻训练显著上调心梗大鼠骨骼肌NRG1、ErbB2和ErbB4表达(P0.05,P0.01)。(2)抗阻训练提高心梗大鼠骨骼肌抗氧化能力。与Sham组比较,MI组大鼠比目鱼肌ROS水平显著升高(P0.05),生化检测反映的抗氧化酶SOD和GSH-Px活性显著降低(P0.05,P0.01)。与MI组比较,抗阻训练显著提升心梗大鼠比目鱼肌SOD和GSH-Px活性(P0.05)。(3)抗阻训练调节心梗大鼠骨骼肌IGF-1、MGF和MSTN及生长信号表达。与Sham组比较,MI组大鼠骨骼肌MSTN表达显著升高(P0.01),IGF-1和MGF表达无显著差异,Akt和Erk1/2磷酸化水平下降(P0.05)。与MI组比较,抗阻训练显著上调心梗大鼠骨骼肌IGF-1和MGF表达(P0.05),抑制MSTN表达(P0.05),激活Akt和Erk1/2磷酸化(P0.05)。(4)抗阻训练调节心梗大鼠骨骼肌Smyd1、Hsp90和MuRF1蛋白表达。与Sham组比较,MI组大鼠比目鱼肌Smyd1表达显著下降(P0.05),Hsp90和MuRF1表达显著上升(P0.05)。与MI组比较,抗阻训练显著上调心梗大鼠比目鱼肌Smyd1表达(P0.05),下调Hsp90和MuRF1表达(P0.05)。7抗阻训练促进心梗心脏血管生成抑制细胞凋亡(1)抗阻训练改善心梗心脏梗死边缘区心肌细胞肥大,促进血管生成。与Sham组比较;MI组大鼠梗死区心肌细胞大量坏死,心肌纤维排列紊乱,出现断裂和肌溶解等现象,梗死区的存活细胞、边缘细胞及梗死远端细胞均出现肥大现象(P0.01),α-SMA和CD105表达显著增加(P0.05,P0.01)。与MI组比较,MR组大鼠梗死区心肌细胞仍存在肥大现象,梗死边缘区细胞代偿性肥大现象有所改善(P0.01),非梗死区心肌细胞无显著性差异,MR组梗死边缘区α-SMA和CD105表达增加(P0.05),非梗死区α-SMA表达增加(P0.05)。(2)抗阻训练抑制心梗大鼠心肌细胞凋亡。与Sham组比较,MI组心肌TUNEL+细胞显著增加(P0.01),Bax/Bcl-2比值显著升高(P0.01)。与MI组比较,抗阻训练显著降低心梗心肌TUNEL+细胞数量和 Bax/Bcl-2 比值(P0.05)。(3)抗阻训练显著上调心梗大鼠循环和心肌NRG1蛋白水平。与Sham组比较,MI组血清和心肌中NRG1蛋白水平无显著变化;与MI组比较,抗阻训练显著提高血清和心肌中NRG1蛋白水平(P0.05)。相关分析表明,骨骼肌NRG1蛋白水平与梗死边缘区心肌细胞横截面积和LVEDP均呈负性相关;与LVSP呈正性相关。比目鱼肌质量与梗死边缘区心肌细胞横截面积和LVEDP均呈负性相关。研究结论:1.抗阻训练、间歇有氧运动和持续有氧运动均可不同程度改善心梗大鼠心功能,缓解骨骼肌萎缩现象。间歇有氧运动和持续有氧运动改善心功能和降低心肌纤维化的效果显著优于抗阻训练,而抗阻训练和间歇有氧运动对改善骨骼肌萎缩效果较为显著。从安全性和有效性等因素综合分析,抗阻训练和持续有氧运动风险性较小,更适合作为心梗后的主要运动康复方式。2.持续有氧运动可激活心梗大鼠心肌NRG1/ErbB和PI3K/Akt信号通路,同时显著增加梗死心脏的心肌细胞DNA合成和c-kit+细胞数量,上调转录因子GATA4和Nkx2.5表达,降低梗死区ROS水平,抑制心肌细胞凋亡和MuRF1泛素化蛋白表达,促进心脏修复。心脏特异性NRG1蛋白过表达可促进心肌细胞增殖,诱导斑马鱼心脏肥大和缺损心脏修复;心脏发育相关基因和smyd1b、hsp90α及murf1等肌节组装与泛素化降解基因,参与NRG1诱导的心脏肥大和心脏缺损后的再生。3.骨骼肌外源性注射rhNRG1可改善心梗大鼠骨骼肌萎缩和心脏收缩功能。抗阻训练可激活骨骼肌NRG1/ErbB4信号,同时提高骨骼肌的抗氧化能力,上调IGF-1、MGF和Smyd1蛋白表达和Erk1/2和Akt磷酸化水平,抑制MSTN、MuRF1和Hsp90α蛋白表达,进而改善心梗大鼠骨骼肌萎缩。抗阻训练可上调心脏和循环中NRG1蛋白水平,改善心梗大鼠心肌细胞代偿性肥大,促进心脏血管生成,抑制细胞凋亡。抗阻训练后骨骼肌中NRG1蛋白水平和比目鱼肌相对质量与心脏保护效应存在相关性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.22
，

本文编号：1935511