缺氧预适应促进心脏祖细胞抗凋亡作用及DNMT1介导的相关机制研究

发布时间：2018-06-01 04:33

  本文选题：心脏祖细胞 + c-kit　； 参考：《东南大学》2017年博士论文

【摘要】：第一部分心脏祖细胞的体外分离培养和纯化目的优化培养条件,探索从成年小鼠心脏组织中的分离培养和纯化c-kit(+)心脏祖细胞(cardiac progenitor cells, CPCs)的有效方法。方法严格无菌条件下取2月龄成年C57BL/6小鼠心脏,剪成1mm3大小,经0.1%胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶充分消化后,加入组织块培养基(complete explant medium,CEM)贴壁培养。2周后,Accutase酶轻柔消化心肌组织块周围的“小、圆、亮”细胞,移入心球生长培养基(cardiosphere-growing medium, CGM)继续培养。待扩增培养充分后,采用免疫磁珠筛选法获得纯化的c-kit(+) CPCs,显微镜观察细胞的形态学特点,流式细胞仪分析所得细胞表面标记c-kit、Scal-1、CD34、CD45的表达。结果心肌组织经充分消化贴壁培养后,约1周可见组织块周围出现大量成纤维样细胞,约2周可见大量“小、圆、亮”细胞附着在成纤维样细胞层上。显微镜下可见经磁珠筛选后的细胞呈克隆样扩增。流式细胞学分析显示筛选后的CPCs表面标记c-kit阳性率达80.17%±5.32%,Sca1-1阳性率为40.37%±4.61%,而CD34阳性率为1.77%±0.08%,CD45阳性率为1.22%±0.21%。结论通过酶消化成年小鼠的心肌组织及磁珠分选纯化,可以方便、稳定的获得高纯度的c-kit(+)CPCs,满足了后续实验的细胞需求。第二部分缺氧预适应对心脏祖细胞抗凋亡作用的影响目的观察缺氧预适应对c-kit(+)CPCs抗凋亡作用的影响,并初步探讨缺氧预适应影响CPCs抗凋亡的可能机制。方法将c-kit(+)CPCs预先置于正常氧(H0)或缺氧环境(0.1%O25%CO294.9%N2)分别培养6小时(H6)后,再置于无糖无血清培养基和缺氧环境下(0.1%O2 5%CO2 94.9%N2)培养24小时(24h),用流式细胞仪Annexin-V/碘化吡啶(PI)双染色法检测细胞凋亡和MTT法分析细胞增殖情况。给予急性心肌梗死模型小鼠心肌内注射经缺氧预适应处理的CPCs,术后7天经胸壁小动物心脏超声检测小鼠心功能,术后28天处死小鼠后取心脏标本行Masson染色观察心脏纤维化面积。用WB (western blot)检测CPCs经缺氧预适应处理后Akt蛋白表达水平。结果缺氧预适应组(H6组)凋亡率(15.05%±1.54%)显著低于正常氧培养组(H0 组)(28.82%±±1.43%)(P0.05)。其作用被 PI3K 阻断剂 LY294002 阻断(H6+24h+LY 组:凋亡率 31.07±1.44%) (P 0.01);而H0组加入胰岛素样生长因子-1 (IGF-1,PI3K激动剂)后,其凋亡率显著下降(H0+24h+IGF 组:17.26±2.13%) (P0.05)。MTT 实验显示 H6 组细胞存活率显著高于HO (P 0.01)。MTT实验显示缺氧预适应促进CPCs存活的效应,同样可被LY294002阻断,而被IGF-1激活。心脏彩超结果显示,H6组心功能及心脏重构改善,左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)均显著高于H0组和PBS组(P0.05);而H6组的左室舒张末容积(LVEDD)和左室收缩末容积(LVESD)均显著小于H0组和PBS组(P0.05)。Masson染色结果表明:H6组小鼠心梗后心脏纤维化面积(29.4%±2.13%)明显低于H0组(40.3%±4.28%)(P0.05),而H6组和H0组心脏纤维化面积明显低于PBS组(49.2%±5.64%) (P0.05),说明移植经缺氧预适应处理的CPCs可显著缩小小鼠心梗面积。WB结果显示:H6组磷酸化Akt (p-Akt)表达水平较对照组显著增高(p0.01); LY294002可阻断其作用,而IGF-1可促进其作用。结论缺氧预适应可以促进CPCs抗凋亡能力,并且这一细胞保护效应可能是经由PI3K/Akt信号通路发挥作用的。第三部分DNMT1介导的缺氧预适应调控p53的机制研究目的观察缺氧预适应通过PI3K/Akt通路对DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)和p53进行调控的机制,并探讨DNMT1与p53之间的关系。观察DNMT1甲基化催化活性对p53的影响,并进一步在转录水平上明确DNMT1对p53的调控机制。方法将c-kit(+ CPCs预先置于正常氧或缺氧环境(0.1%O2 5%C02 94.9%N2)分别培养6小时后,再置于无糖无血清培养基和缺氧环境下(0.1%O25%CO294.9%N2)培养24小时。采用WB检测CPCs经缺氧预适应处理后Akt、DNMTs和p53蛋白表达变化;采用q-PCR (real-time quantitative PCR)检测DNMTs、p53的mRNA表达水平。用siRNA靶向沉默DNMT1,并用5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-azadc)阻断DNMT1的甲基化催化活性,然后用WB检测p53蛋白的表达。查询p53启动子区0至-2000 bp区域内CpG岛的分布情况,通过亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite genomic sequence, BSP)检测该区域所有CpG岛CpG位点的甲基化状态;克隆p53启动子区+157至-2150 bp基因序列从而构建两种报告基因质粒(野生组p53 promoter和突变组p53 promoter (M)),并采用双荧光素酶实验检验DNMT1对p53的调控;采用ChIP实验检验DNMT1是否与p53启动子区直接结合。结果H6+24h组DNMT1和DNMT3β蛋白表达显著升高(p0.01),而p53蛋白表达显著下降(p0.01);LY294002可阻断其作用,而IGF-1可促进其作用。但DNMT3α则在各组间无显著变化(p0.05)。缺氧预适应显著提高了 DNMT1、DNMT3β的mRNA表达水平(p0.01),并抑制了 p53 的 mRNA 表达水平(p0.01 )。DNMT1 被 siRNA 靶向沉默后,p53的表达显著提高(p0.05);而DNMT1的甲基催化活性被阻断后,p53的表达水平同样有显著性提高(p0.05);当同时干扰沉默DNMT1和阻断其甲基催化活性,p53表达则被显著激活(p0.01),与单纯沉默DNMT1或阻断其催化活性相比,p53表达量升高但无统计学差异(p0.05)。p53启动子区共分布有3个CpG岛,H6+24h组p53启动子区所有3个CpG岛甲基化水平与对照组比较,均未发现有统计学差异(p0.05);双荧光素酶实验显示,H6+24h组相对荧光强度要显著低于H0+24h组(p0.01 ),并且其在p53 promoter组要显著低于p53 promoter (M)组(p0.01); ChIP实验显示,缺氧预适应组可扩增出与DNMT1抗体相结合的染色质片段。结论缺氧预适应可能经由PI3K/Akt信号通路上调DNMT1和DNMT3β、抑制p53的表达,并且p53受DNMT1的反向调控。DNMT1可能不是通过影响p53启动子区甲基化水平,而是作为转录因子直接与p53启动子区特定位点相结合来抑制p53的表达。
[Abstract]:The expression of c - kit ( + ) CPCs in adult mouse heart was studied . The positive rate of c - kit ( + ) CPCs was detected by flow cytometry . The positive rate of c - kit ( + ) CPCs was detected by flow cytometry . Results The apoptosis rate of hypoxic preconditioning group was significantly lower than that of normal oxygen culture group ( 28.82 % 卤 1.43 % ) ( P 0.01 ) . The apoptosis rate of hypoxic preconditioning group ( group H 6 + 24h + LY group : 17.26 卤 2.13 % ) was significantly lower than that in normal oxygen culture group ( P 0.01 ) . The effects of hypoxia preconditioning on DNA methyltransferase ( DNMTs ) and p53 protein expression were observed . However , there was no significant change in the expression of p53 protein ( p0.01 ) . However , there was no significant change in the expression of DNMT3伪 ( p < 0.05 ) . The expression level of DNMT3尾 mRNA was significantly increased ( p0.01 ) in hypoxia preconditioning , and the level of p53 mRNA expression was inhibited ( p0.01 ) . Compared with the control group , the expression level of p53 was significantly higher than that in the control group ( p < 0.05 ) , and the expression of p53 was significantly lower than that in the control group ( p < 0.01 ) .
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R541

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本文编号：1962853