miR-4787-5p和miR-4306参与急性主动脉夹层发病机制的初步研究

发布时间：2018-06-18 08:45

  本文选题：miR-4787-5p + miR-4306　； 参考：《郑州大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景及目的急性主动脉夹层(Acute Aortic Dissection,AAD)是一种急性发作、进展快速、死亡率及致残率较高的危重心血管急症。据研究报道,AAD发病率约3.5例/(10万人年),约50%死于48h内,院内死亡率约20%-30%,10年死亡率可达37%-53%。随着医疗技术水平的提高,AAD的死亡率已明显下降,但与冠心病等其它心血管疾病相比,我国AAD的整体治疗水平仍不高,AAD的误诊率、漏诊率、死亡率依然较高。因此,进一步了解AAD的发病过程,对指导研究AAD的早期诊断、及时有效的治疗及并发症的预防具有重要意义。目前国内外关于AAD的发病机制研究甚多,但是其分子发病机制至今尚未完全阐明。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类内源性、非编码、小的RNA分子,长约18-22个核苷酸,具有超强的稳定性,通过与靶基因的3’端非编码区(3’-untranslated region,3’UTR)结合调控其转录水平、翻译水平,然后参与细胞增殖、分化及凋亡等相关的生物学功能的调控。有研究显示,miRNA可以广泛且稳定的在外周血浆或血清中存在,并能通过实时荧光定量RT-PCR(Fluorescence quantitative Reverse Transcription-polymerase Chain Reacto,q RTPCR)的方法检测出来。miRNA表达水平可以随着疾病的病理生理变化而发生改变,因而广泛参与调控各种疾病的发病过程,已有研究发现miRNA在AD的发病过程中起着主要作用。为进一步探究miRNA在AAD中的表达情况,本实验室前期已经通过Agilengt miRNA芯片技术进行分析miRNA的表达谱,初步筛选出在AAD患者和正常人的外周血浆中差异表达的微小RNA,且选出2个表达差异明显的miRNA,即miR-4787-5p和miR-4306。本实验室先前的研究结果为miRNA-4787-5p在AAD与健康对照组血浆中的表达差异具有统计学意义,而miR-4306无统计学意义,这与miRNAs芯片结果不一致。为了能更精确的验证差异表达miRNAs在AAD的表达水平,减小实验误差,本次研究将通过采用荧光定量RT-PCR方法扩大样本量进一步验证血浆中的miR-4787-5p和miR-4306在AAD患者与健康对照组表达水平的差异性。并且,本研究还将初步探索miR-4787-5p和miR-4306在AAD中的靶基因,进而初步探讨其在AAD发病机制中的作用。研究方法本实验分为两组:急性主动脉夹层患者组(AAD组)和健康对照组(Control组)。经医院伦理委员会批准,与所有入组者签署知情同意书。分别收集2015年1月~2017年1月就诊于郑州大学第一附属医院并且确诊为AAD的患者和年龄、性别配比相同的健康对照组的外周静脉血血浆,详细记录入组者的基本临床资料,包括入院时的血压及24小时之内的D-二聚体、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、白细胞(white blood cell,WBC)、红细胞(red blood cell,RBC)、血红蛋白(hemoglobin,Hb)、血小板(platelet,PLT)及心脏彩超测得的升主动脉宽度等。首先,将两组的基本临床资料进行独立样本的t检验或卡方检验,选择具有统计学意义的指标与是否发生AAD进行相关性分析。然后,采用q RT-PCR的方法扩大样本量验证AAD组与对照组血浆中的miR-4787-5p和miR-4306表达水平的差异,并且应用受试者工作曲线(receiver operating characteristic,ROC)计算曲线下面积(area under the receiver operating characteristic curve,AUC)以表明miR-4787-5p和miR-4306对AAD早期诊断的敏感性和特异性。最后,通过生物信息学软件分析推测得到miR-4787-5p和miR-4306的靶基因,并且应用双荧光素酶报告基因实验的方法验证靶基因的准确性。结果1.按排除标准共收集AAD患者102例,其中男性81例,女性21例,年龄28~78岁,平均52.3±10.4岁;对照组58例,男性48例,女性10例,年龄30~77岁,平均年龄53.3±11.6岁。两组人群年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血脂病史差异均无统计学意义(P0.05),两组人群的高血压病史、入院时血压是否升高、升主动脉宽度、D-二聚体、CRP、BNP、WBC、RBC、Hb、PLT的差异均有统计学意义(P0.05)。2.将AAD组和对照组之间具有统计学差异的指标与是否发生AAD进行双变量相关性分析,结果显示:红细胞和血红蛋白与AAD呈弱负相关关系,P0.05,相关系数为0.286、0.291;血小板与AAD呈一般负相关关系,P0.05,相关系数为0.411;高血压与AAD呈一般正相关关系,P0.05,相关系数为0.383;入院时血压升高、脑钠肽与AAD呈显著正相关关系,P0.05,相关系数为0.614、0.644;升主动脉宽度、白细胞、D-二聚体、C反应蛋白与AAD呈高度正相关关系,P0.05,相关系数分别为0.761、0.772、0.820、0.832。3.通过q RT-PCR扩大样本量进行实验,其结果为:AAD患者血浆中的miR-4787-5p和miR-4306的相对表达量均明显高于健康对照组,分别为0.646±0.442 vs 0.189±0.116、0.780±0.323 vs 0.006±0.009,均P=0.0000.010.05,差异均具有统计学意义,且均与本实验室前期的基因芯片检测分析结果一致。应用ROC曲线进行分析,结果显示miR-4787-5p对AAD检测的敏感度78%,特异度为80%,AUC为0.834(95%CI,0.769-0.900),P=0.0000.05,具有统计学意义。miR-4306对AAD检测的敏感度为86%,特异度为88%,AUC为0.921(95%CI,0.876-0.966),P=0.0000.05,具有统计学意义。4.应用生物信息学分析预测结果为:PKD1、TGF-β1的3’UTR区分别包含miR-4787-5p和miR-4306的作用靶点,可能是miR-4787-5p和miR-4306在AAD中的靶基因。5.双荧光素酶报告实验验证结果为:共转染miR-4787-5p agomir和含有PKD1野生型3’UTR区的重组载体组及共转染miR-4306 agomir和含有TGF-β1野生型3’UTR区的重组载体组的细胞的荧光素酶活性出现明显下调(P均0.05)。提示miR-4787-5p和miR-4306分别与PKD1 3’UTR区及TGF-β1 3’UTR区存在相互作用,且这种相互作用使得miR-4787-5p和miR-4306可分别负向调控PKD1和TGF-β1的表达。因此,研究证实PKD1、TGF-β1分别为miR-4787-5p和miR-4306在AAD中的靶基因。结论miR-4787-5p和miR-4306不仅对AAD具有一定的早期诊断价值,而且还可能是参与调控AAD发病机制的因素之一。
[Abstract]:The research background and the purpose of acute aortic dissection are acute attack , rapid progress , death rate and high disability rate . According to the study , the mortality rate is about 20 % -30 % , and the mortality rate is 37 % -53 % . The research shows that miRNA can be widely and stably in peripheral blood plasma or serum . In order to verify the difference of miR - 4787 - 5p and miR - 4306 in plasma of healthy control group , the difference of miR - 4787 - 5p and miR - 4306 in plasma of healthy control group was further verified by using quantitative RT - PCR . The results showed that the relative expression of miR - 4787 - 5p and miR - 4306 was significantly higher than that of healthy control group ( P0.05 ) . The results showed that miR - 4787 - 5p and miR - 4306 respectively contained the target genes of miR - 4787 - 5p and miR - 4306 . The results showed that miR - 4787 - 5p and miR - 4306 respectively contained the target genes of miR - 4787 - 5p and miR - 4306 .
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.1
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本文编号：2034880