雌激素通过TRAIL抑制TNF-α诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移的机制研究

发布时间：2018-07-15 17:22

【摘要】：在全球范围内,动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)具有很高的发病率和致死率,尽管该病理改变常见,但其发病机制尚未得到完全认知。动脉粥样硬化斑块主要呈不规则样位于动脉血管的内膜层,并使内膜下增厚。斑块主要由细胞、结缔组织、脂质以及代谢残片组成,它是由一系列细胞分子调节应答产生的结果。糖尿病、高血压、高脂血症等刺激导致内皮细胞损伤后,均可诱发动脉粥样斑块形成和发展。当内皮细胞损伤后,不同类型的细胞(如内皮细胞、血小板、炎症细胞等),释放多种介质,如生长因子、细胞因子,从而诱发多重效应。这些生长因子或细胞因子可促进血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)从静息状态下的收缩表型向激活状态下的合成表型转化,促进VSMCs增殖和迁移,以及细胞外基质蛋白沉积。斑块的中心部位,是由泡沫细胞和细胞外脂滴形成的中心坏死区,它们被由VSMCs以及富含胶原蛋白的基质所组成的“纤维帽”所包绕。“纤维帽”的状态决定了斑块的稳定性,而VSMCs是影响“纤维帽”是否完好的重要因素。流行病学调查结果表明,女性在绝经前心血管疾病的发病率较低而在绝经后发病率显著上升,并且冠心病的发病率有明显的性别差异,女性患心血管疾病的平均年龄比男性晚10年,这说明雌激素(Estrogen, E2)对心血管系统有保护作用。虽然有相反的研究认为雌激素替代疗法对心血管并无益处,但“机会窗”假说的提出,让人们重新认识,并广泛的接受了雌激素替代疗法,认为在绝经后早期(绝经10年)使用雌激素替代疗法对心血管系统仍有显著的保护作用。研究表明,E2可调节血脂水平,例如,可降低低密度脂蛋白(LDL),提高高密度脂蛋白(HDL)水平,同时E2促进内皮细胞产生一氧化氮(Nitric oxide,NO)诱导血管舒张,从多途径抑制血管损伤应答以及动脉粥样硬化的发生发展。之前有研究显示,E2可以保护内皮细胞功能,促进内皮迁移。另外还发现,E2可抑制脂多糖(LPS)诱导的VSMCs迁移。然而,E2对炎性分子调节的作用机制仍不明确。最近有报道显示,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)可调节心血管功能。TRAIL作为细胞因子TNF家族的同系物,最早于20年前被发现,也被称为Apo-2配体(Apo-2L)或TNF超家族10 (TNFSF10)。TRAIL与Fas有23%同源性,与TNG-a有19%同源性。人的TRAIL属于II型跨膜蛋白,含有281个氨基酸(鼠科动物有291个)。膜结合的TRAIL可以被半胱氨酸蛋白酶切割,形成可溶性TRAIL进入外周循环。可溶性TRAIL主要来源于激活的白细胞,如单核细胞和中性粒细胞。可溶性的TRAIL通过其230位的半胱氨酸残基与二价锌离子相互螯合,促进TRAIL形成有活性的同源三聚体,进而与相应的受体结合发挥不同的生物学效应。TRAIL有强大的抗肿瘤活性,并且作为癌症治疗靶点已进入临床试验阶段。TRAIL除了可诱导肿瘤细胞凋亡,对心血管系统也有强大的保护效应,例如TRAIL基因缺失会增加高血脂小鼠的动脉粥样硬化斑块面积。然而在体外实验中发现,一定剂量的TRAIL同样可以刺激内皮细胞凋亡,VSMCs增殖和迁移,泡沫细胞形成等,这些结果提示增加TRAIL用量也会促进血管炎症反应,导致动脉粥样硬化等不良效应。目前已有研究显示,体内血清中TRAIL表达水平与E2水平呈显著负相关,并且体外实验显示,给予E2处理后,可明显降低外周血单核细胞TRAIL的表达,这表明TRAIL可能是E2的调控靶点。综上所述,本研究将探讨E2对VSMCs中TRAIL的表达影响,并进一步阐明E2抑制VSMCs增殖和迁移的作用机制。第一章E2对VSMCs中TNF-a诱导的TRAIL表达影响为了探讨E2对VSMCs中TNF-a诱导的TRAIL表达影响,我们分别采用ELISA和实时荧光定量PCR方法检测TRAIL蛋白和mRNA表达水平,并用MTT法和细胞划痕实验观察E2对TNF-a诱导的VSMCs增殖和迁移的影响。1.1 TNF-a通过TRAIL促进VSMCs增殖和迁移首先,我们用不同浓度的TNF-α (1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)处理大鼠的VSMCs 24h,分别用ELISA和实时荧光定量PCR方法检测培养液与细胞裂解液中TRAIL蛋白表达浓度以及VSMCs中TRAIL mRNA表达水平。结果显示,TRAIL蛋白表达,与对照组比较,当TNF-α浓度大于等于10ng/ml时可明显增加VSMCs中的TRAIL表达,增长率分别为(56.6±7.8)%、(80.9±9.2)%、(119.1±11.3)%(n=5,*p0.01 vs.CON；**p0.001 vs.CON)；TRAIL mRNA表达水平与对照组比较,同样在TNF-α处理浓度大于等于10 ng/ml时可明显增加TRAIL mRNA表达,增长率分别为(110±10.9)%、(180±13.1)%、(220±13.2)%,(n=5,**p0.01 vs.CON)。其次,我们用MTT方法检测不同浓度TNF-α(1ng/ml、10 ng/m1、50 ng/m1、100 ng/m1)对大鼠VSMCs增殖情况。结果显示,与对照组比较,当TNF-a浓度大于等于10 ng/ml时可明显促进VSMCs的增殖,增殖率分别为(48.6±6.7)%、(66.9±6.9)%、(98.6±8.6)%(n=5,*p0.01 vs.CON；**p0.001vs.CON)。最后,我们用TRAIL的中和抗体阻断TRAIL作用,用细胞划痕实验观察‘TNF-α对大鼠VSMCs迁移能力的影响。结果发现,TNF-α可明显促进划痕大鼠VSMCs向中间空白的划痕区域迁移,而用TRAIL中和抗体(20μg/ml)预孵育24 h,阻断TRAIL信号传导后,TNF-a促进大鼠VSMCs迁移能力明显受到抑制。1.2 E2呈浓度依赖性抑制TNF-a诱导的TRAIL表达为了观察E2对TNF-a诱导的TRAIL表达的影响,我们用模拟生理浓度的E2(10-9M、10-8M、10-7M、10-6M)预处理大鼠再用VSMCs 24h,处理24h,分别用TNF-α (100ng/ml)和实时荧光定量PCR方法检测培养液与细胞裂解液中ELISA的蛋白表达水平以及TRAIL中VSMCs表达水平。结果显示,与TRAIL mRNA空白对照组比较,明显增加TNF-α蛋白表达,增长率为(164±12.5)%(n=5,TRAIL*p0.001 vs.CON),用不同浓度E2(10-9M、10-8M、10-7M、10-6M)预处理24 h后可明显抑制诱导的TNF-α蛋白表达,其抑制率分别为(10.3±3.1)%)、TRAIL(35.0±4.8)%、(21.7±4.6)%、(30.7±6.9)%(n=5,#p0.05 vs.表达,与空白对照组比较,TNF-α; ##p0.01 vs. TNF-α); TRAIL mRNA明显增加TNF-αmRNA表达,增长率为(210±±17.0)%(n=5,*p0.001 vs.CON),用不同浓度TRAILE2(10-9M、10-8M、10-7M、10-6M)预处理24h后可明显抑制诱导的TNF-α表达,其抑制率分别为(18.7±3.6)%、(51.6±3.3)%、(47.4±5.1)%、TRAIL mRNA(44.2±3.8)%(n=5,#p0.05 vs.##p0.01 vs.TNF-α)。TNF-α;1.3 E2呈时间依赖性抑制诱导的TNF-α表达TRAIL我们用10-8M浓度的E2预处理大鼠不同时间(6 h、12 h、24 h、48VSMCsh),再用处理24 h,分别用TNF-α (100g/ml)和实时荧光定量PCR方ELISA法检测培养液与细胞裂解液中蛋白表达浓度以及TRAIL中VSMCs表达水平。结果显示,与空白对照组比较,TRAIL mRNA明显增加TNF-α蛋白TRAIL以及表达,增长率分别为(157.4±11.7)%和(230±±16.9)%(n=5,**p0.001mRNAvs.CON)；用10-8M浓度E2预处理12 h、24 h、48 h后可明显抑制诱导TNF-α的表达,其中蛋白表达抑制率分别为(18.7±5.7)%、(30.3±6.5)%、TRAIL(41.0±3.4)%(n=5,##p0.01 vs.###p0.001 vs.TNF-α;表达NF-α), mRNA抑制率分别为(54.5±6.1)%、(50.3±±5.3)%、(48.9±4.2)%(n=5,##p0.01 vs.1.4 E2通过ERα抑制TNF-α)。诱导的TNF-α表达TRAILE2能够抑制诱导的TNF-a表达,为了确定参与此作用的ER类型,TRAIL我们利用E2(10-8M-)、ERa选择性激活剂PPT(10-9M)以及ERβ选择性激活剂DPN(10-9M)分别预处理VSMCs 24 h,或用ER拮抗剂ICI 182,780(10-6M,提前30 min作用)阻断ER作用后,再用1'NF-α(100 ng/ml)处理24 h,分别用ELISA和实时荧光定量PCR方法检测TRAIL蛋白和mRNA表达情况。结果发现,TNF-α可促进的TRAIL蛋白和mRNA表达,E2和PPT均可抑制TNF-α诱导的TRAIL蛋白和mRNA表达,蛋白抑制率分别为(32.7±4.7)%、(16.8±3.6)%,mRNA抑制率分别为(52.9±5.6)%、(55.9±3.9)%(n=5,*p0.001vs.CON；#p0.05 vs.TNF-α:##p0.01 vs.TNF-α),单独使用DPN则无此效应,而ICI182,780可阻断E2的效应,说明E2是通过ERa抑制TNF-α诱导的TRAIL蛋白和mRNA表达。1.5 E2通过ERα抑制TNF-α诱导的VSMCs增殖和迁移我们用E2(10-8 M)及PPT(10-9M)分别处理VSMCs 24 h,再用TNF-α(100ng/m1)处理24h后,用MTT检测VSMCs的增值率。结果显示,与对照组比较,TNF-α可明显促进VSMCs的增殖,增殖率为(88.44-6.5)%,E2和PPT均可抑制TNF-α诱导的VSMCs增殖,抑制率分别为(23.1±3.5)%、(15.8±3.6)%,(n=5,*p0.001 vs. CON；#p0.01 vs.TNF-α)。细胞划痕实验结果同样显示,与对照组比较,TNF-α可明显促进VSMCs的迁移,而E2和PPT均可抑制TNF-α诱导的VSMCs迁移。小结：TNF-α可增加VSMCs中TRAIL表达,从而促进 VSMCs增殖和迁移,此作用可被E2抑制,并由ERa所介导。第二章E2通过抑制NF-κB通路抑制TRAIL表达为了探讨E2抑制TRAIL表达上调的作用机制,我们用不同的蛋白酶抑制剂筛选出参与此效应的信号通路,并用Western blot方法及活性检测试剂盒观察E2对此通路的调节作用。2.1 TNF-a通过NF-κB上调TRAIL表达我们用不同信号通路抑制剂：NF-κB抑制剂PDTC (20μM)、p38抑制剂ML 3403(50μM)、JNK抑制剂IQ 1 S(20μM)、MEK抑制剂 PD 98059(5μM)和ERK1/2抑制剂FR 180204(20 μM))提前处理VSMCs 24 h后,再用TNF-a继续处理24 h,分别用ELISA和实时荧光定量PCR方法检测TRAIL蛋白和mRNA表达情况。结果发现,’TNF-a可明显促进TRAIL蛋白和mRNA表达,而只有NF-κB抑制剂PDTC处理组TRAIL蛋白和mRNA表达受到抑制,其中蛋白表达抑制率为(44.4±3.3)%,mRNA抑制率为(59.1±5.6)%(n=5,*p0.01 vs.CON；#p0.01 vs.TNF-α)。说明TNF-a促进TRAIL蛋白和mRNA表达是由NF-kB信号通路介导的,而与MAPK信号通路无关。2.2 E2抑制TNF-a诱导的NF-kB p65磷酸化和转位用10..8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs 24 h,再用TNF-a (100ng/ml)处理15 min,用Western blot方法分别检测细胞内p65磷酸化水平,胞浆p65以及胞核内p65蛋白表达水平。结果显示,TNF-a可明显提高p65蛋白磷酸化水平,增加率为(773.0±13.9)%,同时可增加细胞核内p65蛋白表达,增加率为(698.6±19.7)%,即促进p65从细胞质向细胞核转移；用E2预处理的实验组,p65磷酸化水平降低,与单纯的TNF-a处理组比较,抑制率为(89.8±12.9)%,同时还可抑制p65向细胞核内转移,即抑制细胞核内p65蛋白水平,抑制率为(86.2±11.8)%(n=5,*p0.001 vs.CON；#p0.001 vs.TNF-a)。2.3 E2抑制TNF-a诱导的IkBα磷酸化用10-8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs 24 h,再用TNF-α (100ng/ml)处理15 min,用Western blot方法分别检测细胞内磷酸化IkBα水平以及IkBα的总表达量。结果提示,TNF-α可明显提高IkBα蛋白磷酸化水平,增加率为(776.5±17.3)%,此作用可被E2抑制,抑制率为(86.2±6.2)%(n=5,*p0.001 vs.CON,#p0.001vs. TNF-α)。而TNF-P与E2对总的IKBα蛋白表达无显著影响。2.4 E2抑制‘TNF-α诱导的IKK磷酸化及其活性用10-8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs 24 h,再用TNF-α (100ng/ml)处理15 min,用Western blot方法分别检测细胞内磷酸化的IKKα/β/γ。结果显示,TNF-α可明显提高IKKα/β/γ蛋白磷酸化水平,增加率分别为(626.8±13.6)%、(70I.6±19.6)%、(539.7±16.9)%,此作用可被E2抑制,抑制率分别为(85.0±7.3)%、(86.4±6.5)%、(80.8±5.4)%(n=5,*p0.001 vs.CON,#p0.00 1vs.TNF-α)。IKK活性检测试剂盒检测IKKα/β/γ活性。结果同样显示,TNF-a可明显增加IKKa/p/y活性,增加率为(792.0±18.9)%,E2可抑制TNF-a诱导的IKKa/p/y活性增加,抑制率为(86.4±6.1)%(n=5,*p0.001 vs.CON,#p0.001vs. TNF-α)。2.5过表达p65蛋白促进VSMCs增殖和迁移VSMCs转染p65质粒48 h以提高细胞内p65蛋白表达,再用TNF-a (100 ng/mL)或E2(10-8M)处理24 h,作为对照组,细胞转染空载体后再做相同处理,通过MTT检测细胞增殖情况。结果显示,对照组中,TNF-a明显促进VSMCs增殖,增加率为(122.2±12.4)%,且E2可以抑制TNF-α的促增殖效应,抑制率为(27.7±6.9)%,(n=5,*p0.001 vs.CON；#p0.01 vs.TNF-α)。转染质粒组中,TNF-α同样可明显促进VSMCs增殖,增加率为(164.7±5.6)%(n=5,*p0.001vs.CON),但E2抑制作用消失。细胞划痕实验显示,TNF-α处理或过表达p65蛋白后,VSMCs迁移能力明显增强,且E2不能逆转此种条件下]fNF-α促VSMCs迁移的效应。小结：E2通过抑制VSMCs中NF-kB通路,从而抑制TNF-α诱导的TRAIL表达。第三章E2通过促进NO释放抑制NF-kB通路在本部分实验中,为探讨E2抑制NF-kB通路的机制,我们检测了雌激素对于NO释放的影响以及阻断NO后对于NF-kB活性的调控作用。3.1不同浓度E2处理VSMCs促进NO释放我们用不同浓度的E2(10-9M、10-8M、10-7M、10..6M)预处理大鼠VSMCs 24h,测定其对NO释放的影响。结果发现,不同浓度的E2(10-9M、10-8M、10-7M、10-6M)均能促进NO释放,其增加幅度分别为(146.4±9.3)%、(185.2±11.6)%、(165.2±12.8)%、(137.2±10.5)%(n=5,*p0.05 vs.CON;**p0.01 vs.CON)。3.2 E2呈时间依赖性促进NO释放我们用10-8M浓度的E2处理大鼠VSMCs不同时间(6h、12h、24h、48 h)后,检测培养液上清中NO的水平。结果显示,与空白对照组比较,E2处理大鼠VSMCs 6h、12 h、24 h、48 h后均可促进NO释放,其增加幅度为(126.4+8.5)%、(165.2±10.4)%、(213.2±15.6)%、(180.2±12.6)%(n=5,*p0.05 vs.CON；**p0.01 vs.CON)。3.3 NO供体硝普钠(SNP)抑制TNF-α促TRAIL表达的效应我们以NO供体SNP(10..4M)预处理VSMCs 1 h后,用10-8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs 24 h,再用TNF-α (100ng/ml)处理24 h,以ELISA方法检测培养液与细胞裂解液中TRAIL蛋白表达浓度。结果发现,SNP可显著抑制TNF-α诱导的TRAIL蛋白表达,其抑制率为(63.2±6.7)%(n=5,#p0.01 vs.TNF-α);E2(10-8M)同样可以抑制TNF-α对TRAIL蛋白的上调作用,其抑制率为(60.1±7.3)%(n=5,#p0.01 vs.TNF-α),这一作用与SNP作用并不叠加,表明雌激素主要通过NO途径抑制TRAIL蛋白表达。3.4 NO抑制剂L-NMMA抑制E2对TRAIL表达的下调效应我们以NO抑制剂L-NMMA (10-5 M)预处理VSMCs 1 h后,用10-8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs 24 h,用TNF-α (100ng/ml)处理24 h,以ELISA方法检测培养液与细胞裂解液中TRAIL蛋白表达浓度。结果发现,L-NMMA对TNF-α诱导的TRAIL蛋白表达没有影响,但其可显著抑制E2(10-8M)对TRAIL蛋白的下调作用,其抑制率为(58.2±8.8)%(n=5,*p0.01 vs.CON)。3.5 SNP、L-NMMA对于p65/IκBα磷酸化的调控效应我们以NO供体SNP(10-4M)或NO抑制剂L-NMMA(10-5M)预处理VSMCs’1h后,用10-8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs 24 h,再用TNF-α (100ng/ml)处理24 h,Western blot方法检测细胞内磷酸化p65、IκBα水平以及其总表达量。结果表明,SNP可明显抑制TNF-a诱导的p65、1κBα磷酸化,而L-NMMA可明显抑制E2的作用。小结：E2通过促进NO释放,抑制VSMCs中NF-κB通路,从而抑制TNF-α诱导的TRAIL蛋白表达。结论：1. TNF-α诱导VSMCs内TRAIL表达,并促进VSMCs增殖和迁移；2.E2可抑制VSMCs中TNF-a诱导内TRAIL表达,并抑制VSMCs增殖和迁移；3.E2通过促进NO释放,抑制VSMCs中NF-κB通路,从而抑制TNF-α诱导的TRAIL表达以及VSMCs的增殖和迁移。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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