基于临床生化指标的冠心病预测模型建立及其与基因易感性关联的探索研究

发布时间：2018-08-10 20:28

【摘要】：研究背景与目的冠心病(coronary heart disease,CHD)是威胁人类健康的主要疾病。最新统计显示,在发达国家,CHD的死亡率虽然有所下降,但在发展中国家,包括中国,CHD的死亡率仍呈上升趋势。据WHO估计,到2020年左右我国将会迎来CHD的流行高峰。因此提高CHD预防控制水平是我国一项艰巨任务。CHD的病因学说较多,包括脂质浸润学说、神经内分泌学说、同型半胱氨酸代谢障碍学说及与炎症损伤有关的血管内膜损伤学说等。这些病理生理过程最终会引起冠状动脉粥样硬化(atherosclerosis,As),导致心脏供血、供氧等不足、从而危及心脏的正常泵血功能。伴随生物医学的发展,CHD在诊断、治疗及预防等方面都取得了巨大进步。在CHD预测预警机制方面,弗拉明翰心脏研究(Framingham Heart Study)、女性健康研究(the Women's Health Study),明斯特前瞻性心血管研究(the Prospective Cardiovascular Munster study)以及系统冠状动脉风险评估计划(the Systematic Coronary Risk Evaluation project)等已为临床医生提供了多个不同版本的10年期CHD风险评估策略,希望结合并发挥预防医学手段来降低CHD的患病率及死亡率。最近,各国专家对这些风险评估策略的适用性开始提出异议,主要包括：1)人种代表性；2)CHD风险因子的完整性等。人种代表性上,上述评估策略主要针对欧美白种人,不适合其他人种更不适合中国人种；CHD风险因子的完整性上,这些评估策略主要包括年龄(age)、性别、高血压及吸烟,而对血脂、糖化血红蛋白、糖尿病家族史及身体质量指数等因子在CHD预测中的作用还没有一个确定的共识。换言之,结合并发挥预防医学手段来降低CHD的患病率及死亡率这一思路很好,但现有的评估策略还需要完善和改进。从CHD危险因子角度看, age、性别、家族史及人种属于经典的不可改变危险因子(unmodifiable risk factors);抽烟、高血压、血脂异常及糖尿病等属于经典的可改变危险因子(modifiable risk factors)。完善和改进CHD预测机制既要全面科学地纳入这些已知危险因子,同时,还需要不断结合基因医学及计算医学的发展,探讨并吸纳新的危险因子。从基因角度来看,CHD遗传基础可能代表了多个DNA变异的累积。目前,全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS)已在人类基因组报告目录中确定了超过100个与CHD相关的基因变异。而单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)作为一种理解复杂疾病遗传方式的有效研究手段,其在与疾病相关的遗传因素中,会对不同个体疾病易感性产生重要影响,且已在多种疾病中显示出基因多态性分布的个体差异及人种差异。近年,基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)在As中的作用逐渐被重视。研究发现,在人的冠状动脉粥样硬化斑块中检测到SDF-1高表达,主要表达在内皮细胞、平滑肌细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞,而正常动脉壁中未见表达。进一步研究发现,当细胞在受到炎症因子刺激后能分泌SDF-1,SDF-1可激活T淋巴细胞,并能与其受体4(C-X-C hemokine receptortype-4,CXCR4)特异性结合形成SDF-1/CXCR4生物轴,导致细胞内部钙离子及其它化学物质一过性快速升高,从而在个体炎症反应中扮演着重要角色。表明SDF-1/CXCR4生物轴与As的发生关系密切。而编码SDF-1的基因3’非翻译区801号位点(rs1801157)存在G/A多态性,会对SDF-1表达产生影响,故而推断rs1801157位点SNP可能会与As发生的易感性相关。目前对该位点SNP的研究主要集中在与艾滋病和肿瘤的易感性上,很多研究已证实,该基因位点SNP与急性髓细胞白血病、散发性前列腺癌及乳腺癌等多种疾病的发病相关,经检索较少发现有与As发生相关的研究报道。此外,研究发现端粒缩短和端粒酶活性增高均是As形成的重要危险因素。端粒长度由遗传因素和端粒缩短速度决定,而端粒酶除能延长端粒长度外,在维持端粒结构中还起到重要作用。端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)作为端粒酶活性的关键限速成分,其编码基因多态性可影响hTERT蛋白合成,在激活端粒酶活性及功能中起关键性作用。编码hTERT的基因定位于第5号染色体5p15.33区域,该区域上的rs2736100位点位于hTERT编码基因的1号内含子处,在hTERT蛋白的合成中起着关键性作用,负责激活端粒酶,进而推断该位点SNP可能会影响As的发生和发展。但目前的研究也主要集中在与肿瘤的易感性关系上,最近的研究显示rs2736100位点多态性与肺癌、胶质瘤、睾丸生殖细胞癌及膀胱癌的易感性相关,经检索鲜见有与As发生相关的研究报道。与CHD基因易感性的研究不同,临床生化检测中的很多指标能反映人体生理及病理生理代谢的动态过程。一些指标,如血脂,其与CHD的相关性已是经典话题。近年来,国内外在临床生化指标与CHD的相关性研究方面也取得了一定发展。传统运用于肝胆疾病、肾脏疾病及痛风等疾病诊治的经典生化指标血清总胆红素(total bilirubin,TBIL)、血清γ-谷氨酰基转移酶(γ-glutamyltransferase,γ-GT)、血清尿酸(uric acid,UA)等被证实为CHD新的独立危险因素。但这些传统的及新的危险因子却并没有在CHD的预测机制中发挥足够作用,主要表现为：1)新的生化危险因子,如TBIL,UA及γ-GT等缺乏严格设计的大规模人群验证；2)对于传统指标,如血脂指标中的高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)等,过去的很多相关性研究对其在人群中的分布情况缺乏认识,数据的处理比较单调,如缺乏合理的数学转换和综合。已有研究显示,通过对不同指标进行合理整合,如：LDL-C/(HDL-C+TBIL)或LDL-C/HDL-C在CHD危险因素中的重要性远高于其他单独指标。另外,研究结果也显示,综合了TBIL结果的LDL-C/(HDL-C+TBIL)比值与单纯血脂LDL-C/HDL-C比值比较,可极大提高诊断CHD的敏感性。以上这些研究说明,通过整合多项指标可提高对CHD的诊断效能,预示着重新分析整合生化指标来提高CHD预测效能的可能性。如何利用合适的人群,综合分析常规临床生化指标在CHD预测中的效能；如何发现新的CHD易感基因并将基因危险因子与age、性别及临床生化指标等因子有机结合起来；探索一种适合我国汉族人群、具备理想敏感性及特异性的预测机制等问题值得深入研究。我国是一个多民族的人口大国,在疾病的病理生理过程中存在着民族差异,主要表现为：1)不同民族有着不同的遗传背景,即使同为汉族人群,其遗传背景也可能因为人口迁移、异族间通婚等因素变的更加复杂；2)不同民族及城乡人群在生活习惯、饮食特征上均差异明显。因此探索一种适合我国人群、具备理想敏感性及特异性的CHD预测机制具有极大挑战性,不是一个地区一个课题能完成的。为此,本次研究将对象主要锁定为玉溪地区汉族人群,先进行一些探索性研究和验证,再将成果进行扩大和推广。同时,由于玉溪地处云南,少数民族众多,其中的彝族、哈尼族和傣族不论在全省还是全市均为排名前三的少数民族,具有一定的民族代表性,故也希望通过对以上三个少数民族的研究,进而了解民族间基因多态性的差异。综上所述,本次研究目的主要有以下几方面：1.选择玉溪地区汉族健康人群及CHD人群,收集人群的常规生理生化指标,通过统计学分析,明确各指标与CHD的相关性及相关模式,尝试建立对CHD具有较高诊断效能的评估模型。2.通过病例对照研究,探讨SDF-1基因3’端rs1801157位点SNP与玉溪地区汉族CHD人群间的相关性,比较玉溪地区主要民族汉族、彝族、哈尼族和傣族该基因位点基因型及等位基因频率的差异,并与国内外已有研究结果进行比较,了解该基因位点的民族或种族差异性。3.通过病例对照研究,探讨hTERT编码基因1号内含子rs2736100位点SNP与玉溪地区汉族CHD人群间的相关性,比较玉溪地区主要民族汉族、彝族、哈尼族和傣族该基因位点基因型及等位基因频率的差异,了解该基因位点的民族差异性。4.通过将第一章基于传统危险因子得到的数学评估模型运用于第二和第三章研究对象中,除可再次验证模型的有效性和重复性,还希望能从中发现基因易感性与传统危险因子间的关联性,探索基因易感性与传统危险因子联合运用的可能性。方法第一章玉溪地区汉族人群冠心病风险评估数学模型的建立与临床评价1.1研究对象1.1.1建立数学模型所用研究对象选择2010年10月至2013年3月我院心内科确诊的CHD患者男性664例(年龄分布27-87岁,平均年龄62.2岁)为男性病例组；女性385例(年龄分布38-86岁,平均年龄64.9岁)为女性病例组。选择同期健康体检者男性400例(年龄分布24-84岁,平均年龄45.5岁)为男性对照组,女性227例(年龄分布23-71岁,平均年龄43.3岁)为女性对照组。1.1.2验证数学模型所用研究对象选择2013年11月至2014年12月我院心内科确诊的CHD患者男性312例(年龄分布27-82岁,平均年龄61.7岁)为男性病例组；女性119例(年龄分布45-82岁,平均年龄65.5岁)为女性病例组。选择同期健康体检者男性198例(年龄分布26-76岁,平均年龄49.4岁)为男性对照组、女性214例(年龄分布22-77岁,平均年龄46.0岁)为女性对照组。研究对象均按照纳入和排除标准进行严格筛选。所有研究对象均空腹8-12小时(hour,h),于次日清晨抽取外周静脉血5mL,置于带分离胶及促凝剂的生化管(黄色盖子)中,于2h内3000r/min离心10min,分离血清用于生化项目检测。1.2方法1.2.1生化检测项目及方法实验室检测以下血清生化指标：总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、HDL-C、LDL-C、UA、同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)、载脂蛋白A1(apolipoprotein A-1,APOA1)、载脂蛋白B100(apolipoprotein B-100,APOB100)、脂蛋白a[lipoprotein(a),Lp(a)]、TBIL、直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)、γ-GT。均使用瑞士原装进口Roche cobas c 701全自动生化分析仪及配套试剂进行检测。1.2.2 CHD发病预测模型的建立方法及统计学处理采用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理。变量按照男女分层,所有纳入变量首先需经过分布规律观察,掌握其集中和离散趋势；对于偏态分布的变量实施合理数学转换,转换后重新评估其分布特征;正态分布变量用XX±s描述,偏态分布变量用四分位数M(P25,P7s)描述,两组间均数比较采用独立样本t检验,检验水准a=0.05；运用Pearson Correlation coefficient矩阵来确定变量间的相关关系,结合临床及生物化学知识挑选代表性变量以减少混杂因素对后续回归分析的影响；单变量分析各自变量与应变量(CHD)间的差异性,确立P0.1的变量纳入后续logistic回归模型；采用建模人群,运用二分类logistic回归手段建立各变量与CHD相关关系数学模型,确认各预测因子(predictors)与CHD的相关关系及相关系数；运用似然比检验、比分检验及受试者工作特性曲线下面积(area under receiver operating characteristic curve,AUC)等了解logistic回归过程中各变量的似然性、代表性以及各变量在模型中的权重；运用上述结果推导出本地区汉族男性和女性CHD发病风险预测方程；运用验证人群,采用AUC验证上述CHD预测方程的有效性和重复性；将建模人群和验证人群进行合并,确立最终具有很高预测效能和重复性的本地区汉族人群CHD预测机制。第二章玉溪地区汉族人群基质细胞衍生因子基因多态性与冠心病相关性研究2.1研究对象收集2013年4月至2013年10月在我院心内科确诊的汉族CHD患者84例为病例组(其中男性64例,女性20例,年龄分布36-79岁,平均年龄62.4岁)。收集同期进行健康体检的汉族人群257例为对照组,但有4例样本实验中未检测出质谱信号,故未能成功分型,最终253例(男性152例,女性101例,年龄分布26-60岁,平均年龄33.9岁)纳入对照组研究。以上汉族人群均三代以上居住在玉溪地区,无与其他民族通婚或近亲结婚史。本次研究的少数民族人群来源于云南省玉溪市元江哈尼族彝族傣族自治县,标本采集于2014年7月,其中彝族人群标本采集于洼垤乡、哈尼族人群采集于因远镇、傣族人群采集于甘庄街道,以上区域均为该民族自然聚居区。所有对象均无与其他民族通婚或近亲结婚史,保证了民族血统的纯正性。其中,彝族人群169例(男性75例,女性94例,年龄分布22-84岁,平均年龄43.8岁)、哈尼族128例(男性56例,女性72例,年龄分布20-90岁,平均年龄50.1岁)、傣族215例(男性68例,女性147例,年龄分布21-82岁,平均年龄47.8岁)。所有研究对象均空腹8-12h,于次日清晨抽取外周静脉血5mL,置于带分离胶及促凝剂的生化管(黄色盖子)中,于2h内3000r/min离心10min,分离血清用于生化项目检测；另抽取外周静脉血3mL,置于5mL EDTA抗凝管(紫色盖子)中,抽血后立即轻轻充分混匀全血标本,保存于-20℃冰箱,用于提取全血基因组DNA。本研究获玉溪市人民医院医学伦理委员会批准,所有受试者均签定知情同意书。2.2方法2.2.1生化检测项目及方法均使用瑞士原装进口Roche cobas c 701全自动生化分析仪及配套试剂检测了TC、TG、HDL-C、LDL-C、UA、HCY、APOAl、APOB100、Lp(a)、TBIL、 DBIL、γ-GT共计12项生化指标。2.2.2基因组DNA提取、扩增及SNP检测按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(Gaithersburg,MD)厂商说明书从全血中提取100uL基因组DNA,将提取的DNA溶解于20mL含1mmolEDTA的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中,储存于-30C备用。SDF-1基因多态性依照Mass Array(San Diego, CA)用户使用指南进行测定。采用Sequenom Mass Assay Design 4.0(美国sequenom公司)进行引物设计,上海英骏生物公司(invitrogen)负责引物合成。上游引物序列为5'ACGTTGGATGTCACACTGCTGCCTCAGCTC3',下游引物序列为5'ACGTTGGATGACCCCCTTCTCCATCCACAT3',延伸引物序列为5'GCCCTCCCAGAAGAGGCAGACC3'。采用25uL的扩增反应体系,其中PCR扩增体系5uL,该体系中含有NanopureH2O1.85uL、PCR Buffer with MgCl2 (10×)0.625uL、MgCl2(25 mM)0.325uL、dNTPmix(25 mM)0.1uL、Primer mix (500nM each)1.0uL、Genomic DNA(5-10ng/uL)1.0uL、Hotstar Taq(?) (5U/uL)0.1uL。上下游引物各2.0uL, DNA模板4.0uL,用双蒸水将总体积补充至25uL。PCR反应循环参数：94℃预变性15min,94℃变性20s,56℃复性0.5min,72℃延伸1min,共45个循环,72℃延伸3min。利用大小合适的DNA标志物在6.0%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳确认PCR产物。运用Mass Array检测技术测定84例CHD患者和253例健康对照者SDF-1基因3’端rs1801157位点的基因型。Mass Array是基于单碱基引物延伸技术。Mass Array技术使用matrix-assisted激光分解电离time-of-flight (MALDI-TOF)质谱,可直接测定扩增产物的大小,其检测产物的大小与特定的基因型相关。具体方案细节,可参阅Sequenom Mass Array iPLEX平台对于SNP基因分型的使用说明。2.2.3统计学处理采用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理。根据质谱结果,计算基因位点基因型频率及等位基因频率,应用Hardy-Weinberg平衡方程计算出人群中每个等位基因3种基因型的理论值,然后与实际值进行比较(x2检验),以明确其分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。计数资料比较采用χ2检验。计量资料符合正态或近似正态分布的以X±s表示,偏态分布指标用M(P25,P75)表示,将偏态分布资料进行对数转换(ln),使之符合正态或近似正态分布,两组间均数比较采用独立样本t检验,检验水准a=0.05。第三章玉溪地区汉族人群端粒酶逆转录酶基因多态性与冠心病相关性研究3.1研究对象研究对象中病例组情况同第二章。对照组257例样本在该位点均成功分型,故全部纳入对照组研究,其中(男性153例,女性104例,年龄分布18-58岁,平均33.9岁)。研究对象入选及排除标准、标本的采集及处理同第二章。3.2方法3.2.1生化检测项目及方法均使用瑞士原装进口Roche cobas c 701全自动生化分析仪及配套试剂检测了TC、TG、HDL-C、LDL-C、UA、HCY、APOAl、APOB100、Lp(a)、TBIL、 DBIL、γ-GT共计12项生化指标。3.2.2基因组DNA提取、扩增及SNP检测基因组DNA提取及扩增方法同第二章。hTERT基因1号内含子rs2736100位点用于扩增的上游引物序列为5'ACGTTGGATGTGACACCCCCACAAGCTAAG3’,下游引物序列为5'ACGTTGGATGACAAAGGAGGAAAAGCAGGG3延伸引物序列为5'TCCGTGTTGAGTGTTTCT3'.同样采用Mass Array检测技术测定hTERT基因1号内含子rs2736100位点基因型在84例CHD患者和257例健康对照者中的分布情况。2.2.3统计学处理同第二章。第四章基因易感性与数学评估模型联合运用探索4.1研究对象分别为第二章中的病例组84例汉族CHD患者,对照组253例健康体检汉族人群；第三章中的病例组84例汉族CHD患者,对照组257例健康体检汉族人群。4.2方法4.2.1研究方法将第一章基于传统危险因子得到的数学评估模型运用于第二和第三章研究对象中,计算每例样本的模型值,按不同性别,分别比较两组人群病例组和对照组的差异,以及不同等位基因或基因型间模型值的差异。4.2.2统计学处理采用SPSS 20.0统计软件包,建立数据库。计量资料用X±s表示,多样本均数间比较采用方差分析,两样本均数间比较采用独立样本t检验,检验水准α=0.05。结果第一章玉溪地区汉族人群冠心病风险评估数学模型的建立与临床评价通过严格质量控制的统计学分析,对临床生化指标实施合理筛选,可极大提高预测CHD的诊断效能,研究结果最终显示在本地区汉族人群中：age和lnHCY为男性和女性共同的危险因子,HDL-C为共同的保护因子,lnTBIL、lnTG和lnLp(a)为男性特有独立相关因子,lnγ-GT为女性特有独立相关因子。最终的男性CHD预测模型方程为：Probability(CHDmale final)=1/{1+exp-(-6.846+0.102 age-3.316HDL-C-0.677lnTG+0.481lnLp(a)+2.195lnHCY-0.725lnTBIL)}；最终的女性CHD预测模型方程为：Probability(CHDfemalefinal)=1/{1+exp-(-15.356+0.180age-3.105HDL-C+2.938lnHCY+0.904lnγ-GT)}.第二章玉溪地区汉族人群基质细胞衍生因子基因多态性与冠心病相关性研究rs1801157位点病例组基因型分布频率如下：G/G为50例(59.5%),G/A为30例(35.7%),A/A为4例(4.8%)。对照组基因型分布频率如下：G/G为120例(47.4%),G/A为111例(43.9%),A/A为22例(8.7%)。各基因型间差异无显著性。病例组G和A等位基因分布频率分别为77.4%和22.6%,对照组G和A等位基因分布频率分别为69.4%和30.6%。病例组G等位基因频率高于对照组(P=0.047),差异存在显著性。玉溪地区主要民族傣族、哈尼族、彝族、汉族(对照组)间该位点基因型和等位基因频率差异均存在显著性,汉族对照组等位基因频率还与国内外已有研究的多个民族或种族间差异存在显著性。第三章玉溪地区汉族人群端粒酶逆转录酶基因多态性与冠心病相关性研究rs2736100位点病例组基因型分布频率如下：G/G为15例(17.9%),G/T为48例(57.1%),T/T为21例(25.0%)。对照组基因型分布频率如下：G/G为25例(9.7%),G/T为171例(66.5%),T/T为61例(23.7%)。病例组G/G基因型频率高于对照组(P=0.044),差异存在显著性。病例组G和T等位基因分布频率分别为46.4%和53.6%,对照组G和T等位基因分布频率分别为43.0%和57.0%,等位基因分布频率两组间无显著性差异。玉溪地区主要民族傣族、哈尼族、彝族、汉族(对照组)间该位点基因型和等位基因频率差异均存在显著性。第四章基因易感性与数学评估模型联合运用探索在rs1801157和rs2736100两个基因位点,男性和女性病例组模型计算值均高于对照组,差异有显著性意义；在rs1801157位点,男性G等位基因组模型计算值高于A等位基因组模型计算值,而女性G等位基因组模型计算值低于A等位基因组模型计算值；在rs2736100位点,男性和女性均为易感基因型G/G组模型计算值最高。结论1.通过严格质量控制的统计学分析,对常见生化指标实施合理筛选,可以得到较为理想的CHD风险评估模型。2.病例对照研究显示,SDF-1基因rs1801157位点G等位基因可能为玉溪地区汉族人群CHD的相关危险因素,该基因位点SNP存在民族或种族差异性。3.病例对照研究显示,hTERT基因rs2736100位点G/G基因型可能为玉溪地区汉族人群CHD的相关危险因素,不同民族间该位点SNP存在差异性。4.基因易感性与风险评估数学模型间存在一定关联性,将基因易感性因素与传统危险因子进行有机结合,可能会完善和提高对CHD评估的效能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.4;R446.1

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