血小板微粒促进血管新生的作用和机制研究

发布时间：2018-08-31 09:37

【摘要】：研究背景血管新生在整个生命过程中都发挥着重要的作用,与胚胎发育、伤口愈合、动脉粥样硬化斑块失稳定、肿瘤的发生发展等多种生理病理过程都密切相关。广义的血管新生,又叫血管形成(vascularization),主要包括三种形式:血管生成(vasculogenesis)、血管新生(angiogenesis)和动脉形成(arteriogenesis)。其中血管新生(angiogenesis)是在既已存在的血管基础上,通过血管内皮细胞活化、增殖、迁移等最终以“出芽”的形式实现血管丛的扩张。血管内皮细胞除参与形成基本的血管网络结构外,亦能分泌多种因子,形成特定的组织和细胞微环境,调节组织生长和修复。血小板是参与血管病变的重要细胞成分。血小板到达损伤的内皮部位后迅速被激活,释放出大量的血小板微粒(platelet microvesicles,PMVs)。PMVs是一群直径为0.1-1.0μm大小的超微膜性囊泡,拥有与血小板类似的重要生物学功能,涉及体内多种生理和病理反应。近年来有研究显示,PMVs还可通过携带多种促血管生成因子(VEGF、PDGF、bFGF等),增强内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成能力,诱导内皮祖细胞的分化,促进血管新生。本课题组前期研究发现,金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白5(staphylococcal superantigen-like protein 5,SSL5)激活产生的PMVs可以促进单核细胞中炎症因子(IL-1β、TNFα、MCP-1及MMP-9)的表达,诱发炎症反应。因此,我们推测PMVs调节内皮细胞分泌谱的改变可能是其参与血管新生的另外一种新机制,旨在为更加全面地了解和认识血小板功能提供新的实验证据,同时也为探索血管新生相关疾病的防治奠定基础。研究内容1.体外制备凝血酶受体活化肽6(thrombin receptor activator peptide 6,TRAP-6)激活的PMVs,采用流式细胞术进行鉴定,BCA法进行定量。培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),台式液作为空白对照(Con),PMVs制备过程中的上清液作为溶剂对照(Sup),利用基质胶管腔形成实验检测PMVs对HUVECs成管能力的影响;CCK8法检测其对细胞增殖的影响;划痕实验和transwell迁移实验检测细胞的迁移状况。2.培养HUVECs,台式液作为空白对照,PMVs制备过程中的上清液作为溶剂对照,实时定量PCR检测PMVs对HUVECs相关促血管生成因子(HIF-1a、VEGF-A、FGF-2、IL-8、MMPs)m RNA表达的影响,Western Blot检测MMPs的蛋白表达水平,明胶酶谱法检测MMPs的活性。同时利用抑制剂干扰MMPs的活性,以及CD40L、CD40和P-选择素的中和性抗体干扰PMVs与HUVECs间CD40L/CD40和P-选择素/PSGL-1的结合,研究其对HUVECs成管能力及迁移的影响。3.采用6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠,于小鼠皮下注入基质胶栓,在体研究PMVs的促血管新生作用。研究结果1.PMVs在体外具有显著的促血管新生效应。(1)PMVs较Con与Sup,可显著增强HUVECs的成管能力,且呈剂量效应;(2)PMVs较Con可显著促进HUVECs的增殖,但其促增殖效应与Sup相当,不呈剂量依赖性;(3)PMVs较Con与Sup,呈剂量依赖性地促进HUVECs的迁移。2.PMVs体外促血管新生的机制。(1)PMVs对于HUVECs促血管生成相关因子(HIF-1α、VEGF-A、FGF-2、MMP-7、TIMP-1)m RNA的表达没有影响;但可呈剂量依赖性地抑制IL-8 mRNA的表达;(2)PMVs较Con与Sup,可显著促进HUVECs表达和分泌MMP-2/9,并增强其活性,呈剂量依赖关系;(3)MMPs全抑制剂GM6001可以明显抑制PMVs对HUVECs的促成管和促迁移效应;(4)MMP-2特异性抑制剂抑制PMVs促成管和促迁移能力的作用强于MMP-9特异性抑制剂;(5)CD40L-CD40与P-selectin-PSGL-1的相互作用并不参与PMVs的促血管新生过程。3.PMVs促进体内血管新生的作用和相关机制(1)PMVs在体内具有显著的促血管新生效应;(2)MMPs全抑制剂GM6001可显著抑制PMVs在体内的促血管新生效应;此外,MMP-2特异性抑制剂的效果明显优于MMP-9特异性抑制剂。研究结论PMVs在体内外均具有显著的促血管新生效应。同时,PMVs的促增殖作用虽与Sup(溶剂对照)相当;但诱导迁移能力更加显著,且呈剂量依赖效应。在机制方面,PMVs主要通过促进内皮细胞MMP-2/9的表达,并上调其活性,降解细胞外基质,增强内皮细胞的迁移能力,最终促进血管新生;其中MMP-2发挥的作用可能更大。本研究阐述了PMVs参与血管新生的一种新机制,以期能更加全面地了解和认识血小板功能,同时为血管新生相关疾病的防治奠定基础。
[Abstract]:Background Angiogenesis plays an important role in the whole life process, which is closely related to embryonic development, wound healing, atherosclerotic plaque instability, tumor development and other physiological and pathological processes. Vasculogenesis, angiogenesis, and arteriogenesis. Angiogenesis is the expansion of vascular plexus by activation, proliferation and migration of vascular endothelial cells on the basis of existing blood vessels. Vascular endothelial cells participate in the formation of basic vascular network besides the formation of vascular endothelial cells. Platelets are important cellular components involved in angiopathy. Platelets are activated rapidly when they reach the injured endothelium and release a large number of platelet microvesicles (PMVs). PMVs are a group of 0.1-diameter platelets. In recent years, studies have shown that PMVs can also enhance the proliferation, migration and lumen formation of endothelial cells and induce endothelial progenitor cells by carrying a variety of angiogenic factors (VEGF, PDGF, bFGF, etc.). Our previous study found that PMVs produced by staphylococcal superantigen-like protein 5 (SSL5) activation could promote the expression of inflammatory factors (IL-1 beta, TNF alpha, MCP-1 and MMP-9) in monocytes and induce inflammation. The alteration of cell secretion profile may be another new mechanism of its involvement in angiogenesis, aiming at providing new experimental evidence for a more comprehensive understanding of platelet function and laying a foundation for the prevention and treatment of angiogenesis-related diseases. Content 1. Preparation of thrombin receptor activator 6 (thrombin receptor activator) in vitro HUVECs were cultured in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), desktop solution was used as blank control (Con), supernatant during the preparation of PMVs was used as solvent control (Sup), and matrix colloidal formation test was used to detect the effect of PMVs on HUV. The effect of PMVs on HUVECs-related angiogenesis factors (HIF-1a, VEGF-A, VEGF-A) was detected by real-time quantitative PCR with the supernatant of PMVs preparation as solvent control. Effects of FGF-2, IL-8, MMPs)m RNA expression, Western Blot assay for MMPs protein expression and gelatin zymogram assay for MMPs activity. Inhibitors interfered with MMPs activity and neutralizing antibodies against CD40L, CD40 and P-selectin interfered with the binding of CD40L/CD40 and P-selectin/PSGL-1 between PMVs and HUVECs to study their tubing ability to HUVECs. The angiogenesis of PMVs was studied in vivo by subcutaneous injection of matrix glue in 6-8 weeks old male C57BL/6J mice. Results 1. PMVs had significant angiogenesis effect in vitro. (1) Compared with Con and Sup, PMVs could significantly enhance the tubule formation ability of HUVECs in a dose-dependent manner; (2) PMVs could significantly promote the angiogenesis of HUVECs compared with Con. The proliferation of HUVECs was similar to that of Sup in dose-dependent manner; (3) PMVs promoted the migration of HUVECs in a dose-dependent manner compared with Con and Sup; (2) PMVs promoted angiogenesis in vitro. (1) PMVs had no effect on the expression of HUVECs angiogenesis-related factors (HIF-1a, VEGF-A, FGF-2, MMP-7, TIMP-1) m RNA; however, PMVs did not affect the expression of HUVECs in a dose-dependent manner. Inhibiting IL-8 mRNA expression in a dose-dependent manner; (2) PMVs significantly increased the expression and secretion of MMP-2/9 in HUVECs compared with Con and Sup, and enhanced the activity of MMP-2/9 in a dose-dependent manner; (3) GM6001, a total inhibitor of MMPs, could significantly inhibit PMVs-mediated and migration-promoting effects on HUVECs; (4) MMP-2 specific inhibitors inhibited PMVs-mediated and migration-promoting effects. The interaction between CD40L-CD40 and P-selectin-PSGL-1 was not involved in the angiogenesis of PMVs. 3. The role of PMVs in promoting angiogenesis in vivo and its related mechanisms (1) PMVs had significant angiogenesis-promoting effect in vivo; (2) GM6001, a total inhibitor of MMPs, could significantly inhibit the angiogenesis of PMVs in vivo. In addition, the effect of MMP-2 specific inhibitors was significantly better than that of MMP-9 specific inhibitors. Conclusion PMVs have significant angiogenic effects in vitro and in vivo. At the same time, the proliferation-promoting effect of PMVs is similar to that of Sup, but the migration-inducing ability of PMVs is more significant and dose-dependent. By promoting the expression of MMP-2/9 in endothelial cells, up-regulating its activity, degrading extracellular matrix, enhancing the migration ability of endothelial cells, and ultimately promoting angiogenesis, MMP-2 may play a greater role. This study elaborated a new mechanism of PMVs involved in angiogenesis, in order to better understand and understand the function of platelets. It lays the foundation for prevention and treatment of angiogenesis related diseases.
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘欣,石应康,祝彼得;培养内皮细胞的分化[J];生物医学工程学杂志;1999年02期

2 卫朝霞,刘永波;一种新的内皮细胞分离方法[J];河南职工医学院学报;2003年03期

3 任德成;胡娟娟;张均田;杜冠华;;血管内皮细胞损伤机制研究[J];医学研究通讯;2003年10期

4 潘虹;王庭槐;;内皮细胞caveolae,caveolin-1的生理功能[J];医学综述;2006年22期

5 殷观梅;;血管内皮细胞生长抑制因子研究进展[J];河北医药;2008年12期

6 刘宝宜,陈铁镇,张宝庚,宋继业;动脉粥样硬化形成过程中内皮细胞病变的研究(摘要)——主动脉内皮细胞平掙,扫描电镜及透射电镜的观察[J];中国医科大学学报;1981年S1期

7 刘宝宜,陈铁镇,张宝庚,宋继业;动脉粥样硬化形成过程中内皮细胞的形态学变化的研究(主动脉内皮细胞平铺技术,扫描电镜及透射电镜的方法)[J];中国医科大学学报;1982年03期

8 张连元;;动脉粥样硬化发病机理中平滑肌和内皮细胞的机能[J];煤矿医学;1983年04期

9 刘怀琼;李德馨;;内皮细胞的功能与休克的关系[J];国外医学.麻醉学与复苏分册;1985年04期

10 何泽涌;;关于内皮细胞研究的某些进展[J];山西医药杂志;1987年03期

相关会议论文 前10条

1 应大君;陈卫军;周丁华;;内皮细胞机械感受功能的实验研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展（下册）[C];1999年

2 邓红;李懿萍;来茂德;;高糖环境细胞间相互作用对内皮细胞产生活性氧和血管内皮细胞生长因子的影响[A];中华医学会病理学分会2005年学术年会论文汇编[C];2005年

3 林萍章;PualJ.Pearson;RaymondCartier;KazuhiroHashimoto;HartzellV.Schaff;;内膜再生过程中,内皮细胞之反应[A];海峡两岸电子显微学讨论会论文专集[C];1991年

4 赵彭涛;李志超;董明清;贾斌;张莉莉;;LPS对培养的BPAECsⅠ型Na~+/H~+交换器活性的影响[A];第六次全国缺氧和呼吸病理生理学术会议论文摘要汇编[C];2003年

5 熊建琼;朱佩芳;王正国;蒋建新;;髓样分化蛋白-2在内毒素与内皮细胞结合中的作用[A];第十一次全国急诊医学学术会议暨中华医学会急诊医学分会成立二十周年庆典论文汇编[C];2006年

6 王心华;甄永苏;;烯二炔类抗生素力达霉素抑制内皮细胞生长和诱导内皮细胞凋亡[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

7 李彦荣;应晨江;易海维;衣卫杰;孟依;刘烈刚;孙秀发;;绿茶多酚对牛内皮细胞窖蛋白-1表达的影响[A];湖北省、武汉市营养学会第十一届学术会议论文汇编[C];2007年

8 蔡绍皙;张莉;韩亚刚;蒋稼欢;;流动腔底面内皮细胞图型化研究与图像处理[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年

9 汪毅;陈允钦;;高密度脂蛋白与内皮功能[A];第六次全国中西医结合心血管会学术会议论文汇编[C];2002年

10 马向红;黄体钢;杨万松;周丽娟;;四氢生物喋呤对内皮细胞产生一氧化氮和超氧阴离子的影响[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年

相关重要报纸文章 前6条

1 ;中药抗血栓机理及对内皮细胞的生物医学研究取得佳绩[N];科技日报;2000年

2 赵军;耳毒性药物对耳蜗螺旋动脉平滑肌和内皮细胞电生理特性的影响项目[N];科技日报;2007年

3 华朋;热爱老年事业 投身老年医药[N];中国老年报;2000年

4 高国起;提升ACE2活性可消退动脉硬化斑块[N];中国医药报;2010年

5 李娅杰 张奉春;新型非甾体抗炎药研究进展[N];中国医药报;2003年

6 付东红;北大基础医学院基质金属蛋白酶作用机理初步揭示[N];人民日报海外版;2003年

相关博士学位论文 前10条

1 白云城;LPS调控静脉内皮细胞膜形态及通透性引发血栓形成的实验研究[D];昆明医科大学;2015年

2 宋恩;内皮细胞源性KLF15调控TM激活蛋白C抗凝血途径及MCP-1介导炎性反应影响DVT形成的实验研究[D];昆明医科大学;2015年

3 宋凯;口腔癌—内皮细胞融合的分子调控机制及潜在作用[D];武汉大学;2014年

4 薛珊珊;用代谢组学方法研究DNA甲基化对花生四烯酸代谢的影响及血管内皮激活的机制[D];天津医科大学;2015年

5 李强;Rho GTPases及其信号通路在1-磷酸鞘胺醇介导的内皮细胞功能变化中的作用[D];南方医科大学;2013年

6 陈学军;SUR2B/Kir6.1通道开放剂介导内皮细胞保护效应分子途径的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

7 王苏阳;埃他卡林对体循环、脑循环、肺循环微动脉内皮细胞SUR2B/Kir6.1通道的激活作用及能量代谢物质的调节作用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

8 苑t，

本文编号：2214598