Th17细胞在骨髓增生异常综合征发病机制中的作用

发布时间：2018-09-08 16:52

【摘要】：目的:通过检测不同危度骨髓增生异常综合征患者及健康人体内Th17细胞及其相关细胞因子在外周血及骨髓中的表达水平,分析Th17细胞数量与MDS患者血液学指标之间的相关性,体外研究重组人IL-17刺激前后MDS患者骨髓单个核细胞中CD3+CD8+细胞相关效应分子表达水平的变化,进而探索并阐明Th17细胞在MDS发病机制中的作用。背景:骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndromes,MDS)是血液系统常见的恶性病之一,是一组以骨髓无效造血和病态造血、进展性骨髓衰竭并伴有遗传学及分子学异常且不同风险向急性白血病转化为特点的异质性疾病,也是起源于造血系统的恶性克隆性疾病。大量研究表明T淋巴细胞数量及功能的异常在其发病机制中起重要作用,我们实验组前期研究发现MDS患者体内辅助性T细胞Th1、Th2及二者比值、NK细胞、调节性T细胞均出现数量和(或)功能上的异常。Th17细胞是一种近年发现的辅助性T细胞家族中的一员,维甲酸相关孤核受体γt(Retinoid-related Orphan nuclear Receptorγt,RORγt)是其进行分泌活动的关键转录因子,Th17细胞的命名由其特异性分泌的IL-17而来,同时其增殖、分化及分泌功能受IL-23、IL-6及信号传导及转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription-3,STAT-3)调控。Th17细胞在炎症性疾病及自身免疫性疾病中扮演重要角色已在大量文献数据中得到证实。近几年,相关研究陆续证实了Th17细胞在恶性肿瘤中发挥重要作用,但其究竟发挥抗肿瘤免疫作用还是发挥促进肿瘤生长的作用及通过何种途径发挥作用尚存在争议。MDS作为一种常见的恶性血液系统疾病,Th17细胞在其发病机制中的作用罕有研究。因此,本研究将MDS患者分为低危组MDS(low risk MDS,L-MDS,包括低危及中危-1MDS患者)和高危组MDS(high risk MDS,H-MDS,包括中危-2和高危MDS组)两组,通过检测L-MDS和H-MDS患者及健康对照者Th17细胞及其相关细胞因子在外周血及骨髓中的表达水平,分析Th17细胞数量与MDS患者的血液学指标之间的相关性,并应用重组人IL-17(human recombinant IL-17,rhIL-17)刺激MDS患者骨髓单个核细胞进而检测刺激前后CD3+CD8+细胞相关效应分子表达水平的变化,进而探索并阐明Th17细胞在MDS发病机制中的作用。材料与方法:我们首先应用流式细胞术检测35名MDS患者(L-MDS患者18名,h-mds患者17名)和18名健康对照(healthycontrol,hc)外周血及骨髓中以cd3+cd4+il-17+为流式标记的th17细胞比例(th17细胞/cd3+cd4+细胞),进而应用定量方法酶联免疫吸附试验检测42例mds患者和23名健康人细胞因子il-17、il-6、il-23在外周血血浆及骨髓上清中的浓度;提取外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmnc)及骨髓单个核细胞(bonemarrowmononuclearcell,bmmnc)中的总mrna,逆转录获得cdna,采用sybrgreenii实时荧光定量聚合酶链式反应(rt-pcr)检测与th17相关的效应分子il-17及关键转录因子rorγt、stat-3mrna的表达水平以评估th17的功能和激活状态,将th17细胞数量与mds患者血液学指标做相关性分析。以rhil-17模拟体内il-17作用,体外刺激mds患者bmmnc并检测刺激前后cd3+cd8+细胞(cytotoxictlymphocyte,ctl)中细胞毒性颗粒穿孔素(perforin,per)、颗粒酶(granzymeb,gb)及凋亡配体fasl表达率的变化,探索并阐明th17细胞在mds患者发病机制中的作用。结果:1.l-mds组患者pb中th17细胞比例(4.42±2.59%)明显高于hc组(2.73±1.32%,p=0.006)及h-mds组(1.42±0.79%,p0.001),同时h-mds组th17细胞比例明显低于hc组(1.42±0.79%vs2.73±1.32%,p=0.032);l-mds组患者bm中th17细胞比例(4.32±2.76%)显著高于hc组(2.93±1.21%,p=0.018)及h-mds组(1.37±0.84%,p0.001),后两者之间比较亦具有显著性差异(2.93±1.21%vs1.37±0.84%,p=0.02)。l-mds组患者pb中th17细胞占t淋巴细胞的比例(2.12±0.90%)明显高于hc组(1.47±0.63%,p=0.011)及h-mds组(0.92±0.63%,p0.001),同时h-mds组th17细胞占t淋巴细胞的比例明显低于hc组(0.92±0.63%vs1.47±0.63%,p=0.031);l-mds组患者bm中th17细胞占t淋巴细胞的比例(2.26±1.05%)显著高于hc组(1.56±0.63%,p=0.014)及h-mds组(1.04±0.69%,p0.001),后两者之间比较亦有显著性差异(1.56±0.63%vs1.04±0.69%,p=0.029)。染色体正常组mds患者bm中th17细胞比例(4.559±2.6839%)较异常组(1.343±0.651%)明显升高(p0.001),pb中th17细胞比例染色体正常与异常组比较亦有显著差异(4.631±2.519%vs1.399±0.748%,p0.001);染色体核型好、中、差3组pb中th17细胞比例分别为4.591±2.605%、2.450±1.217%、0.913±0.363%,两两比较p值均小于0.05,bm中th17细胞比例分别为4.686±2.661%、2.921±0.933%、0.882±0.441%,两两比较p值均小于0.05;l-mds组患者pb中th17比例与中性粒细胞绝对值(absoluteneutrophilcount,anc)、血红蛋白(hemoglobin,hb)浓度均呈正相关(r=0.731,p=0.006;r=0.492,p=0.038),l-mds组患者bm中th17细胞比例与anc、hb浓度亦呈正相关(r=0.866,p0.001;r=0.478,p=0.045);mds患者bm及pb中th17细胞比例与患者bm涂片中原始细胞比例呈负相关(r=0.7936,p0.001;r=0.7936,p0.0001)2.h-mds组患者pb血浆中il-17浓度(22.44±5.64pg/ml)明显低于l-mds组(30.29±5.97pg/ml,p0.001)及hc组(28.11±4.64pg/ml,p=0.01);h-mds组患者bm中il-17浓度(131.67±49.71pg/ml)明显低于l-mds组(199.71±61.49pg/ml,p0.001)及hc组(173.59±52.70pg/ml,p=0.015);h-mds组患者pb血浆中il-23浓度(42.77±13.35pg/ml)明显低于l-mds组(66.21±20.54pg/ml,p0.001)及hc组(54.20±15.40pg/ml,p=0.030),后两组比较p=0.019,h-mds组患者bm中il-23浓度(77.75±30.01pg/ml)明显低于l-mds组(137.54±47.32pg/ml,p0.001)及hc组(106.96±36.69pg/ml,p=0.011),后两组比较p=0.017,亦有统计学意义;h-mds组患者il-6(4.152±2.497pg/ml)明显低于l-mds组(7.834±3.977pg/ml,p=0.001)及hc组(6.377±3.578pg/ml,p=0.038),h-mds组患者bm中il-6浓度(10.467±5.131pg/ml)明显低于l-mds组(17.659±5.874pg/ml,p0.001)及hc组(14.550±4.483pg/ml,p=0.012),l-mds与对照组浓度比较差异亦有统计学意义(p=0.049)。3.l-mds组患者pbmnc中il-17的mrna相对表达量(11.81±4.77)明显高于hc组(7.46±3.05,p=0.021)及h-mds组(4.72±2.91,p0.001),同时hc组与h-mds组之间存在显著性差异(4.72±2.91vs7.46±3.05,p0.001);同样,l-mds组患者bmmnc中il-17mrna的相对表达量(10.66±3.18)显著高于hc组(8.78±2.84,p=0.035)及h-mds组(5.00±2.76,p0.001),后两者之间比较亦存在显著性差异(8.78±2.84vs5.00±2.76,p0.001)。l-mds组患者pbmnc中rorγtmrna的相对表达量(0.201±0.084)明显高于hc组(0.148±0.069,p=0.016)及h-mds组(0.100±0.063,p0.001),同时h-mds组与hc组之间存在显著性差异(0.100±0.063vs0.148±0.069,p=0.034);与pb一致,l-mds组患者bmmnc中rorγtmrna的相对表达量(0.406±0.180)显著高于hc组(0.319±0.127,p=0.046)及h-mds组(0.187±0.097,p0.001),后两者之间比较亦存在显著性差异(0.319±0.127vs0.187±0.097,p=0.003)。l-mds组患者pbmnc中stat-3mrna的相对表达量(0.316±0.132)明显高于hc组(0.240±0.123,p=0.032)及h-mds组(0.165±0.083,p0.001),同时h-mds组与hc之间存在显著性差异(0.240±0.123vs0.165±0.083,p=0.037);l-mds组患者bmmnc中stat-3mrna的相对表达量(0.416±0.126)显著高于hc组(0.329±0.146,p=0.042)及h-mds组(0.225±0.087,p0.001),后两者之间比较差异亦有显著性(0.329±0.146vs0.225±0.087,p=0.004)。4.l-mds组、h-mds组患者ctl占bmmnc百分比低于hc组(16.285±9.426%vs22.382±8.628%,15.589±7.906%vs22.382±8.628%,p值均小于0.05),l-mds与h-mds两组间比较无显著差异(p=0.8140.05);与ctl占单个核细胞百分比结果一致,l-mds组、h-mds组患者bm中ctl细胞占t淋巴细胞百分率低于hc组(37.209±12.213%vs46.759±14.439%,35.990±10.332%vs46.759±14.439%,p值均小于0.05),l-mds与h-mds两组间比较亦无显著差异(p=0.0770.05图4.3)。mds患者bm中ctl细胞per、gb、fasl表达率与患者bm中原始细胞比例呈负相关(r=-0.5443,p=0.0007;r=-0.6022,p=0.0001;r=-.5329,p=0.001),且与h-mds组比l-mds组ctl中per、gb、fasl表达率均显著升高(4.607±3.560%vs2.373±2.290%,p=0.035;47.324±16.940%vs34.270±18.947%,p=0.039;14.570±7.894%vs9.391±6.378%,p=0.041)。mds患者bm中ctl的per、gb、fasl表达率与患者bm上清中il-17浓度呈正相关(r=0.4012,p=0.0169;r=3685,p=0.0294;r=0.5388,p=0.0008)。rhil-17刺激后bm中ctl的per、gb及fasl表达率均较刺激前明显升高(4.56±4.23%vs3.52±3.17%,p0.01;59.47±16.47%vs40.61±18.98%,p0.01;13.94±10.58%vs12.11±8.69%,p0.05)。l-mds与h-mds组患者刺激前后per、gb、fasl表达率比值无显著性差异(p值分别为0.161,0.27,0.98),同时刺激后h-mds组与刺激前l-mds组per、gb、fasl表达率比较无差异(p值分别为0.567,0.451,0.482)。结论:(1)th17细胞在mds发病中主要通过抑制恶性克隆起保护性作用;(2)th17细胞可能选择性杀伤恶性克隆,在一定程度上解除了恶性克隆对正常造血的抑制,保持了正常造血克隆的相对优势;(3)染色体异常组th17比例较染色体正常组显著减低,且th17细胞比例越低,染色体恶性度越高,进一步表明th17细胞可直接或间接杀伤畸变的恶性克隆。(4)th17细胞上游分子il-6、il-23水平异常可能是引起th17细胞数量功能异常的罪魁祸首;(5)Th17细胞可能通过IL-17/CTL途径发挥抗肿瘤效应。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R551.3

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