溶血磷脂酰胆碱与分子伴侣GRP78在心脏缺血再灌注损伤中的作用及机制的研究

发布时间：2018-10-05 10:35

【摘要】：冠状动脉粥样硬化性疾病是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)使管腔狭窄或阻塞,导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病。根据世界卫生组织发布的全球疾病状况评估报告显示,过去十年因缺血性心脏病死亡的人数占人类疾病死亡总数的48.6%,位居首位。尽管目前通过及时有效PCI手术或者溶栓疗法可以减少心梗面积并且改善临床预后,但是这种再灌注疗法在改善缺血心肌血流供给的同时会带来另一种损伤,称之为心脏缺血再灌注损伤。心脏缺血再灌注损伤的病理机制,主要认为与心肌钙离子超载、活性氧的大量释放、细胞内酸碱平衡的波动以及炎症反应作用有关,但是心脏缺血再灌注损伤的机制还需要进一步阐述。心脏缺血再灌注损伤通常分为四种类型:第一种为心肌细胞的顿抑,一种心肌在经过短时缺血后恢复血液供应,心肌出现持续数天至数周的功能障碍,这一损伤通常可逆并且最终冠脉血流可以恢复正常。心肌顿抑与心脏能量代谢障碍密切相关;第二种为无复流现象,主要是由于心脏微循环在结构或功能上的变化,使得灌注缺血区域的冠脉没有血液供给;第三种为再灌注导致的心律失常;第四种为致死性再灌注损伤。溶血磷脂酰胆碱是一类含磷的类脂化合物,机体内溶血磷脂酰胆碱主要来源于细胞膜的磷脂双分子以及载脂蛋白表面的磷脂酰胆碱,在磷脂酶A1的作用下磷脂酰胆碱甘油主链第一个碳原子的脂肪酸被水解生成2-酰基-溶血磷脂酰胆碱,而磷脂酶A2则水解甘油主链第二个碳原子生成1-酰基-溶血磷脂酰胆碱。心脏缺血再灌注损伤可以造成细胞膜上的磷脂酰胆碱的降解,激活的磷脂酶A2使得脂肪酸在细胞膜上的积累,不饱和脂肪酸花生四烯酸被认为可以促进再灌注阶段的炎症反应,而其他的脂肪酸具有缓解心脏缺血再灌注损伤的作用。另一方面,溶血磷脂酰胆碱可以引起心肌细胞钙离子超载而影响大鼠心脏的机械与代谢活动,因此被认为与心律失常相关。许多刺激包括细胞内外的氧化还原反应都可以诱导内质网应激。在心脏缺血再灌注损伤中心肌缺血区内质网应激分子伴侣GRP78的表达显著高于缺血边缘区和边缘远区。过表达内质网应激IRE1信号通路下游分子XBP1后,GRP78明显升高,心梗面积出现明显下降,这说明内质网应激信号通路在保护心脏缺血再灌注损伤中起到重要作用。既往研究报道内质网应激还可以增强磷脂酶iPLA2β的活性,并且在抑制iPLA2β的活性后可以显著减轻内质网应激诱导的凋亡的作用。因此,我们提出这一假设:在心脏缺血再灌注损伤中溶血磷脂酰胆碱的升高一方面可以激活内质网应激,而内质网应激分子伴侣GRP78的升高对心脏缺血再灌注损伤具有保护作用;另一方面溶血磷脂酰胆碱的升高可以引起邻近内皮细胞的炎症反应,可能是造成心脏缺血再灌注损伤无复流的一个重要因素。第一部分体外心肌缺血再灌注损伤中溶血磷脂酰胆碱表达以及内质网应激的变化目的:观察在缺血再灌注损伤中心肌的死亡以及细胞形态变化,同时检测缺血再灌注损伤后细胞内与细胞外溶血磷脂酰胆碱浓度的变化。观察在缺血再灌注损伤中内质网应激的激活情况,检测内质网应激中重要分子伴侣GRP78以及GRP94的表达与分布。方法与结果:通过构建体外心肌缺血再灌注模型模拟缺血再灌注损伤,从缺血时间和再灌注时间上控制变量,乳鼠心肌经过3个小时的缺氧和过夜再灌注处理后,可以造成近40%的细胞死亡是常氧对照组细胞死亡的4倍(P0.001);而经过6个小时缺氧与过夜再灌注处理的细胞可以造成78%的细胞死亡,与常氧对照组相比上升了近6倍(P0.001)。采用BD公司Calibur流式检测经缺氧6小时和再灌注过夜后的心肌细胞,与常氧组相比可以观察到明显的细胞形态的改变。通过溶血磷脂酰胆碱高效液相色谱法检测试剂盒测定溶血磷脂酰胆碱,可以观察到经过缺氧后细胞内溶血磷脂酰胆碱的浓度明显上升,而细胞上清中溶血磷脂酰胆碱的浓度也显著升高(P0.001)。除此之外,心肌缺血再灌注损伤可以激活内质网应激通路,分子伴侣GRP78与GRP94的表达上调,并且分子伴侣GRP78在细胞膜上的分布也显著增加。结论:体外心肌缺血再灌注损伤中可以诱导细胞内外溶血磷脂酰胆碱表达并且激活内质网应激信号通路。第二部分溶血磷脂酰胆碱和分子伴侣GRP78对心脏缺血再灌注损伤的调控作用目的:为了明确溶血磷脂酰胆碱对内质网应激的调控作用,观察外源性溶血磷脂酰胆碱对分子伴侣GRP78的表达的影响。为了明确GRP78对于心脏缺血再灌注损伤的作用,构建心肌特异性过表达GRP78转基因小鼠以及敲除GRP78的小鼠,观察内质网应激分子伴侣GRP78对于心脏缺血再灌注的保护作用以及具体的机制。方法与结果:实验中分别给予乳鼠心肌细胞0～80μM溶血磷脂酰胆碱,12个小时后60μM～80μM的溶血磷脂酰胆碱明显上调分子伴侣GRP78的表达。构建αMHC-Cre和CAG-loxP-STOP-loxP-GRP78双阳性的在心肌细胞中特异性过表达GRP78蛋白小鼠,并将单阳性或者野生型的小鼠作为实验对照组。所有的小鼠都给予结扎前降支45分钟,再灌注24小时的缺血再灌注处理。分离心脏组织并用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)进行染色,结果显示与对照组相比在心肌细胞过表达GRP78可以降低缺血再灌注后的心梗面积(p0.05),降低心梗后纤维化的程度,并且过表达GRP78可以激活Akt信号通路。构建αMHC-mER-Cre-mER和GRP78flox/flox小鼠,在小鼠第12周龄时给予腹腔注射他莫昔芬10mg/kg连续5天,剪切基因组中GRP78序列进而在心肌中特异性敲除GRP78蛋白。在注射他莫昔芬第十二天后敲除GRP78的小鼠缩短分数(FractionShortening,FS)明显下降并引起小鼠死亡。结论:溶血磷脂酰胆碱可以上调乳鼠心肌细胞内质网应激分子伴侣GRP78的表达,过表达GRP78的小鼠可以减少缺血再灌注后心梗面积和降低纤维化程度,这可能与Akt信号通路的激活有关。条件性诱导敲除GRP78以后小鼠心脏功能下降并引起小鼠死亡。第三部分外源性溶血磷脂酰胆碱对内皮细胞炎症反应的作用及机制的研究目的:观察溶血磷脂酰胆碱诱导内皮细胞释放炎症因子白介素-8的情况,进一步检测NF-κB以及类泛素化修饰在炎症调控中的作用并且评估了内皮细胞释放白介素-8对单核细胞的粘附作用。方法和结果:溶血磷脂酰胆碱溶解在PBS中,分别给予内皮细胞40、60和80μM溶血磷脂酰胆碱的浓度梯度。经过3个小时的作用,内皮细胞上清中白介素-8的释放随着溶血磷脂酰胆碱处理浓度的升高而升高,内皮细胞核区域出现了 p65亚基的转位。除此之外,经过溶血磷脂酰胆碱处理后内皮细胞-162IL-8启动子序列荧光素酶的活性显著上升(P0.001),而AP-1和NF-κB序列突变的荧光素酶的活性没有显著改变。另一方面,在敲低Ubc9和HDAC4后溶血磷脂酰胆碱对白介素-8的上调作用明显减弱,在敲低Ubc9后溶血磷脂胆碱对于IκB蛋白降解作用明显延迟。最后溶血磷脂酰胆碱可以显著促进内皮细胞与单核细胞THP-1的粘附作用,而使用白介素-8抗体后内皮细胞与单核细胞的粘附作用显著减轻。结论:溶血磷脂酰胆碱可以通过增加类泛素化作用激活NF-κB通路上调白介素-8的表达,进而促进内皮细胞与单核细胞的粘附作用。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R541.4

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