硫化氢改善自发性高血压大鼠肾动脉内皮功能紊乱及其机制研究

发布时间：2018-10-05 17:56

【摘要】：第一部分硫化氢通过抑制NLRP3/IL-1β通路改善自发性高血压大鼠肾动脉内皮功能目的:原发性高血压往往伴有内皮功能紊乱,可能与体内氧化应激和免疫机制紊乱有关,氧化应激状态下NLRP3炎症小体被激活,而其下游的促炎因子IL-1β能够直接破坏血管内皮功能。继一氧化碳(CO)、一氧化氮(NO)被发现之后,硫化氢(H_2S)作为第三类气体信号分子而被发现,其具有改善血管内皮功能紊乱等多种心血管保护作用,但是作用机制不甚清楚。本部分研究利用SHR高血压模型,在体和离体给予Na SH,以探讨H_2S对NLRP3/IL-1β通路和血管内皮功能的影响。方法:1实验分组:在体实验分为四组,分别为京都Wistar大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)组,WKY+硫氢化钠(Na SH)组,自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)组,SHR+Na SH组。其中Na SH组动物从8周龄开始,每日腹腔注射给予Na SH 100μmol/kg,至24周龄结束。离体实验分为五组,选取24周龄实验大鼠,分别为1)WKY组2)SHR组3)SHR+H_2S(100μmol/L)组4)SHR+LPS(10μg/ml)组5)SHR+LPS+H_2S组。2利用鼠尾动脉测压系统测量每组动物的鼠尾动脉收缩压(Systolic blood pressure,SBP),从8周测量至24周,每两周测量一次。3在体实验在动物满24周后取其两侧肾脏内微动脉二级分支,行微血管环张力测定,测定其内皮依赖的舒张功能和内皮依赖的收缩功能。离体实验无菌分离两侧肾脏内微动脉二级分支,放入培养箱中离体孵育16小时后,行微血管环张力测定,测定其内皮依赖的舒张功能和内皮依赖的收缩功能。4通过Western blot技术测定肾脏微动脉内H_2S生成酶CSE,氧化应激相关蛋白Nrf2,NOX4,P67phox,SOD,CAT,和IL-1β通路蛋白NLRP3,Caspase-1和IL-1β的表达。5取24周动物血浆,液相色谱-质谱法测量血浆H_2S水平;化学法测定血浆丙二醛(MDA)含量;ELISA法测定血浆IL-1β含量。结果:1在慢性给药结束时,SHR组动物的鼠尾动脉收缩压(SBP)明显高于WKY组,给予Na SH后可以明显降低SHR的血压,具有统计学差异,而对WKY血压几乎无影响。2 SHR血浆H_2S水平和CSE水平明显降低于WKY组,而给予Na SH后H_2S补充了高血压动物内源性硫化氢的不足,上调了CSE酶表达,使H_2S水平增加。3 SHR组肾动脉对乙酰胆碱(Ach)诱导的内皮依赖舒张反应性较WKY组明显下降,而内皮依赖的收缩反应显著增强。外源性给予Na SH可以显著改善内皮依赖性舒张功能,抑制过强的内皮依赖收缩反应。离体孵育H_2S可显著改善SHR大鼠受损的内皮依赖性血管舒张功能,抑制其内皮依赖性收缩功能,而给予LPS激活NLRP3通路后H_2S的这种保护作用被取消。4 SHR肾动脉内的氧化应激蛋白NOX,P67phox水平升高,而抗氧化蛋白Nrf2,SOD,CAT表达下降,慢性给予Na SH可以明显下调氧化蛋白的表达和上调抗氧化蛋白的表达。此外,慢性给予Na SH降低了SHR血浆中氧化应激标志物丙二醛(MDA)的水平。而体外急性给予LPS激活NLRP3通路后H_2S的这种抗氧化趋势被取消。5 SHR肾动脉内的NLRP3/caspase-1/IL-1β通路蛋白表达明显增高,慢性给予Na HS可明显下调上述炎症通路的表达。另外,慢性给予Na SH降低了SHR血浆IL-1β水平。体外孵育实验给予LPS过度激活SHR体内的NLRP3通路后,上述蛋白未见明显增加,而再给予Na SH发现其对炎症蛋白的下调作用消失。结论:外源性给予H_2S可增强SHR内皮依赖性的血管舒张功能,抑制其过强的内皮依赖的收缩功能,进而降低SHR血压。H_2S这种改善内皮功能的作用可能是通过抑制NLRP3炎症通路,及阻断其与氧化应激之间的相互作用来实现的。第二部分硫化氢通过上调Nrf2蛋白增强抗氧化能力发挥内皮保护作用目的:核因子红细胞-2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2-related actor 2,Nrf2)最初认为与红细胞的分化和发育有关,越来越多的研究认为其与氧化应激密切相关。Nrf2是核因子转录家族的成员,在一般情况下处于抑制状态,与分子伴侣Keap-1结合,当细胞受到氧化刺激时,转录因子Nrf2和立刻从Keap1上解离下来并进入细胞核,随后与抗氧化反应元件(ARE)结合,启动抗氧化基因,促进下游抗氧化蛋白的合成。本部分实验旨在讨论H_2S的内皮保护作用是否可以通过上调人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)内的Nrf2蛋白表达,增强细胞的抗氧化能力而实现。方法:1应用CCK-8法测定HUVECs活性预先半小时向细胞培养基中加入不同梯度浓度H_2S(0μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L),AngⅡ1Μm/L刺激6h后观察HUVECs活性的变化。2 HUVECs用慢病毒基因敲除Nrf2,并分为六组:1)阴性对照(Negative control,NC)组2)NC+血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)1μmol/L组3)NC+ AngⅡ 1μmol/L+H_2S 100μmol/L 组4)Nrf2敲除(Small interferce RNA,si RNA)组5)Si RNA+ AngⅡ 1μmol/L 组6)Si RNA+ AngⅡ 1μmol/L+H_2S 100μmol/L 组活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平使用DHE染色法测定。Nrf2,SOD,CAT,NOX4,P67phox,NLRP3,Caspase-1,IL-1β的表达经过Western blot法测定。结果:1 AngⅡ可明显降低HUVEC活性,而H_2S可以提高HUVECs的生物活性,并且呈剂量依赖性。2 DHE染色发现AngⅡ能明显增加ROS水平,H_2S可显著降低ROS水平。基因敲除Nrf2后ROS水平明显增加,且H_2S降低ROS的作用被减弱。3与NC组相比,NC+AngⅡ组和三个Si RNA基因敲除组的Nrf2蛋白表达降低,氧化蛋白NOX4,P67phox表达增加,抗氧化蛋白SOD,CAT表达量减少,在NC组给予H_2S后可以上调Nrf2,SOD和CAT的表达,降低氧化蛋白NOX4,P67phox的表达,而在Nrf2被敲除后再给予H_2S则这种逆转作用被消除。4与NC组相比,NC+AngⅡ组和三个Si RNA基因敲除组的NLRP3,Caspase-1,IL-1β表达量增加,在NC组给予H_2S后可以下调上述蛋白表达,而在Nrf2被敲除后再给予H_2S这种下调作用消失。结论:H_2S通过提高Nrf2的表达,增强抗氧化蛋白的表达,降低氧化应激,从而抑制其下游的炎症因子表达,提高内皮细胞活性,来发挥保护内皮细胞和抗高血压的作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R544.1

【参考文献】