【摘要】：第一部分转录相关增强子-1对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞衰老的影响 目的：以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为研究对象,观察转录相关增强子-1(RTEF-1)对过氧化氢诱导的HUVECs衰老的影响。 方法：将pXJ40/RTEF-1质粒转染入HUVECs中,再用500μg/mLG418筛出稳定转染的细胞。将人工设计并合成的阴性对照(negative control siRNA)序列和RTEF-1siRNA1,2序列分别瞬时转染HUVECs。采用RT-PCR和western blot检测转染细胞中RTEF-1过表达效率和RTEF-1siRNA对该基因的抑制效率。 体外用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5%CO2环境中培养HUVECs,以1×106个细胞每孔种板,再将细胞随机分为7组：(1)对照组；(2)H2O2组：给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(3)阴性对照组：给予稳定转染空白质粒的HUVECs含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h;(4) RTEF-1过表达组：给予稳定转染RTEF-1过表达的HUVECs含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(5)negative control siRNA组：用negative control siRNA转染细胞6h,再给予含100μmol/LH202的培养基预孵育48h；(6)RTEF-1siRNA1组：用RTEF-1siRNA1转染细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(7)RTEF-1siRNA2组：用RTEF-1siRNA2转染细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h。使用衰老相关p-半乳糖苷酶染色进行衰老细胞计数,流式细胞分析细胞周期。并用RT-PCR和Western-blot检测RTEF-1mRNA和蛋白表达。 结果：与阴性对照组相比,RTEF-1过表达组HUVECs的RTEF-1mRNA和蛋白表达明显升高。与阴性siRNA对照组相比,RTEF-1siRNA1和2转染HUVECs后可抑制RTEF-1表达,作为后续实验所需的siRNAs干预组(p0.05)。与对照组比较,H202刺激组p-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例增加,细胞衰老明显,并且流式分析细胞周期显示H202刺激组停滞在G0/G1期细胞比例增加,而S期细胞比例减少。这些提示H202诱导了HUVECs衰老。与阴性对照组相比,RTEF-1过表达组p-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例减少,细胞周期分析中停滞在G0/G1期细胞比例减少。与此相反,RTEF-1siRNA1,2组p-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例增加,细胞周期分析中停滞在G0/G1期细胞比例也增加。 结论：给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育HUVECs48h,可致血管内皮细胞衰老。过表达RTEF-1减少了H202诱导的血管内皮细胞衰老,而RTEF-1siRNA增加了H2O2诱导的血管内皮细胞衰老,说明RTEF-1具有保护H202诱导的血管内皮细胞衰老的作用。 第二部分转录相关增强因-1在过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞衰老中对细胞周期关键基因的调控作用 目的：以人脐静脉内皮细胞为研究对象,探讨RTEF-1在H2O2诱导HUVECs衰老过程中,对调节细胞周期的关键基因p53和p21的调控作用。 方法：HUVECs随机分为5组：(1)阴性对照组：给予稳定转染空白质粒的HUVECs含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(2)RTEF-1过表达组：给予稳定转染RTEF-1过表达的HUVECs含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(3)negative control siRNA组：用negative control siRNA转染细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h;(4)RTEF-1siRNA1组：用RTEF-1siRNA1转染细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(5)RTEF-1siRNA2组：用RTEF-1siRNA2转染细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h。RT-PCR和Western-blot分别检测p53和p21mRNA和蛋白表达。 结果：与阴性对照组相比,RTEF-1过表达组细胞p53和p21mRNA和蛋白表达明显减少。而与阴性siRNA对照组相比,RTEF-1siRNA1和2转染HUVECs后增加了p53和p21mRNA和蛋白表达。 结论：RTEF-1可以减少H202作用后细胞内p53和p21表达,而p53和p21表达的改变可能是RTEF-1减少H202作用后G0/G1期细胞比例的一个原因。这进一步说明RTEF-1参与了血管内皮细胞抗衰老过程。 第三部分Klotho激活在转录相关增强子-1抗衰老过程中的作用 目的：以人脐静脉内皮细胞为研究对象,探讨Klotho基因是否参与了RTEF-1抗衰老的过程。 方法：将人工设计并合成的阴性对照(negative control siRNA)序列和Klotho siRNA1,2序列分别转染入空白对照HUVECs和RTEF-1过表达HUVECs中。分别使用RT-PCR和western blot检测Klotho siRNA对该基因的抑制效率。 HUVECs随机分为11组：(1)阴性对照组：给予稳定转染空白质粒的HUVECs含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(2)RTEF-1过表达组：给予稳定转染RTEF-1过表达的HUVECs含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(3)negative control siRNA组：用negative control siRNA转染细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h;(4)RTEF-1siRNA1组：用RTEF-1siRNA1转染细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(5)RTEF-1siRNA2组：用RTEF-1siRNA2转染细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h。(6)negative control siRNA转染control HUVECs组：用negative control siRNA转染control:细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h;(7) Klotho siRNA1转染control HUVECs组：用Klotho siRNA1转染control细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h;(8)Klotho siRNA2转染control HUVECs组：用Klotho siRNA2转染control-细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(9)negative control siRNA转染RTEF-1过表达HUVECs组：用negative control siRNA转染RTEF-1过表达细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h;(10) Klotho siRNA1转染RTEF-1过表达HUVECs组：用Klotho siRNAl转染RTEF-1过表达细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h；(11)Klotho siRNA2转染RTEF-1过表达HUVECs组：用Klotho siRNA2转染RTEF-1过表达细胞6h,再给予含100μmol/L H2O2的培养基预孵育48h。使用衰老相关p-半乳糖苷酶染色进行衰老细胞计数和流式细胞分析细胞周期,并用双荧光素酶试剂盒检测Klotho启动子活性。RT-PCR和Western-blot检测Klotho, p53和p21mRNA和蛋白表达。 结果：与阴性对照组相比,RTEF-1过表达组Klotho mRNA和蛋白表达明显增加,而RTEF-1siRNAl和2转染HUVECs后Klotho mRNA和蛋白表达减少。而且RTEF-1可呈浓度依赖性地激活Klotho启动子活性。Klotho siRNA同时增加了转染control HUVECs及RTEF-1过表达]HUVECs组中β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例和G0/G1期细胞比例。另外,Klotho siRNA上调了转染control HUVECs组的p53和p21mRNA和蛋白表达,但是对RTEF-1过表达组影响不大。 结论：RTEF-1可以上调Klotho表达及激活其启动子活性。Klotho siRNA可以阻断RTEF-1保护H202诱导的血管内皮细胞衰老的效应,并且上调了p53和p21表达。进一步说明了RTEF-1是一个抗衰老的基因,并且是通过调控Klotho发挥作用。 第一部分肺炎衣原体感染对人脐静脉内皮细胞脂质代谢的影响 目的：本实验以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象,体外研究肺炎衣原体(C.pn)感染对HUVECs脂质代谢的影响。 方法：体外增殖培养C.pn。体外用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养HUVECs,以1×106个细胞每孔种板,再将细胞随机分为3组：(1)阴性对照组：给予含50mg/L低密度脂蛋白(LDL)的培养基培养48h；(2)C.pn感染组：在负荷50mg/L LDL的条件下,给予1×106IFU C.pn感染48h；(3)阳性对照组：给予含50mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的培养基培养48h。显微镜下观察鉴定C.pn有无感染HUVECs.运用硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)方法检测脂质过氧化量。运用酶比色法检测细胞内总胆固醇(TC)及胆固醇酯(CE)含量改变。 结果：与阴性对照组比较,C.pn感染的HUVECs的上清,而不是细胞裂解物使LDL氧化(p0.05)。此外,与阴性对照组比较,C.pn感染增加负荷LDL的HUVECs的TC和CE含量(p0.05)。而与阳性对照组比较,TC和CE含量差异无明显统计学意义(p0.05)。 结论：在负荷LDL的条件下,C.pn感染48h后,可诱导HUVECs的LDL氧化及紊乱脂质代谢。 第二部分肺炎衣原体感染对参与人脐静脉内皮细胞脂质代谢关键基因表达的影响 目的：本实验以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象,观察参与细胞内脂质代谢关键基因：清道夫受体A(SR-A1)、B (CD36)、酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)、ATP结合盒转运体A1(ABCA1)和G1(ABCG1)在肺炎衣原体扰乱内皮细脂质代谢中的作用。 方法：HUVECs随机分为3组：(1)阴性对照组：给予含50mg/L低密度脂蛋白(LDL)的培养基培养48h；(2)C.pn感染组：在负荷50mg/L LDL的条件下,给予1×106IFU C.pn感染48h；(3)阳性对照组：给予含50mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的培养基培养48h。分别运用RT-PCR和Western-blot方法检测各组SR-A1、 CD36、ACAT1、ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表达。 结果：与阴性对照组相比,C.pn感染HUVECs能上调SR-A1、CD36和ACAT1mRNA和蛋白表达,并且下调ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表达(所有p0.05)。与阳性对照组相比,SR-A1、CD36、ACAT、ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表达差异无明显统计学意义(p0.05)。 结论：C.pn感染负荷LDL的HUVECs后,增加SR-A1、CD36和ACAT1表达,抑制ABCA1和ABCG1表达,从而破坏内皮细胞脂质代谢的稳态,进而可能致内皮功能受损。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
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