血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞TFAM表达的影响

发布时间：2018-11-04 14:36

【摘要】：背景:血管紧张素产生于肝脏,经体内转化后形成血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ),其受体广泛分布于人体的血管内皮上。Ang-Ⅱ作用于内皮细胞后,产生大量活性氧(ROS),ROS的大量累积引起的氧化应激可导致细胞损伤,尤其是早期表现为对线粒体的影响;氧化应激诱导的血管内皮线粒体的损伤及功能障碍,是动脉血管粥样硬化产生的早期阶段。Ang-Ⅱ作为目前最强大的血管收缩的活性物质之一,广泛存在于血管平滑肌上;且其在血管内可与其表面受体结合,来介导ROS信号的通路传导:诱导Rac及P40向细胞膜移动,激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的氧化反应,促进ROS产生。适量的ROS可上调存活途径,进而增强相关抗氧化应激基因的表达;随着ROS浓度的升高,可诱导线粒体DNA损伤,进而导致细胞凋亡。线粒体的早期损伤主要表现为调节及组成线粒体的生物合成蛋白减少。其中,线粒体转录因子A(TFAM)作为线粒体转录及复制的关键激活因子及调节因子,在氧化应激中起重要作用。TFAM是在细胞核中产生并转移进入细胞线粒体内;作为调控因子可调节线粒体DNA的转录、翻译和合成后的修饰;在心力衰竭、心肌缺血引起的再灌注损伤等氧化应激下,TFAM作为保护因子可对抗活性氧引起的细胞线粒体损伤。TFAM作为核基因编码的一种小分子多肽,可维护线粒体DNA的完整性,从而抑制细胞凋亡。正常机体中氧化应激损伤时,TFAM增加的表达量,可导致线粒体的含量增加,线粒体的膜电位增高及凋亡量减少。有研究显示细胞受到氧化应激时,细胞内的G蛋白偶联—CAMP反应原件结合蛋白(PKA-CREB)通路激活,上调过氧化物酶体增生物激活受体r共激活因子(PGC-1α)、核呼吸因子-1(NRF-1)的表达量,进而增加TFAM的表达量;TFAM与线粒体DNA的亲和力增加,调节线粒体DNA的拷贝数,维护线粒体DNA的完整和稳定,促进线粒体DNA的损伤修复。然而,随着氧化应激产物的异常积累会损伤细胞核DNA的功能导致TFAM的表达量降低。有研究显示可能与细胞自身的负反馈相关,细胞在受到ROS刺激后,线粒体内TFAM的含量增加导致核内的TFAM与NRF-1结合形成免疫共沉淀,导致NRF-1的表达量降低,进而引起细胞质内的TFAM表达量降低,同时有研究显示,细胞质中Lon蛋白水解酶可以使磷酸化的TFAM裂解,高浓度的ROS抑制HSP60-70-TFAM-Lon复合物的形成,从而抑制线粒体的生物合成。因此,Ang-Ⅱ作用于内皮细胞,细胞的功能变化尚需进一步研究。本实验通过探讨不同浓度的Ang-Ⅱ作用于内皮细胞,观察细胞TFAM的表达及细胞功能变化,为进一步早期检测和防治动脉粥样硬化提供理论依据。目的:探讨血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对血管内皮细胞线粒体转录因子A(TFAM)的表达情况及细胞功能的影响。方法:1细胞来源:本实验采用原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)(Scien Cell公司)。2实验分组及干预:收集对数生长期的HUVECs细胞,调至1x106/m L接种于6孔板培养12小时,加入药物终浓度为10-7、10-6、10-5mol/L的Ang-Ⅱ作为实验组(分别为B、C、D组),对照组(A组)不加药物。实验组和对照组均培养于不加血清的培养基中。3采用蛋白印迹(Western-blot)技术,检测各组细胞TFAM在蛋白水平的表达差异。4采用实时荧光半定量技术(RT-PCR),检测各组细胞TFAM在基因转录水平的表达差异。5采用流式细胞仪监测各组细胞内线粒体膜电位、细胞凋亡率。6数据统计分析:应用SPSS19.0统计学软件,计量资料以均数±标准差表示,采用单因素方差分析比较多组数据,P0.05表示差异有统计学意义。结果:1不同浓度Ang-Ⅱ作用于HUVECs TFAM蛋白、TFAMm RNA的表达水平不同浓度的Ang-Ⅱ(0,10-7,10-6,10-5mol/L)作用于细胞24小时后,各组TFAM蛋白相对表达量为0.94±0.04、0.78±0.09、0.48±0.09、0.40±0.07,实验组蛋白表达量均较对照组减少,具有一定的浓度依赖性,B、C、D组蛋白相对表达量与A组相比,P均0.01;同时A、B、C、D组TFAM m RNA的相对表达量分别为0.94±0.08、0.78±0.09、0.44±0.07、0.40±0.08,与TFAM蛋白的表达水平相似,B、C、D组TFAM m RNA相对表达量与A组相比,P均0.01。2各组细胞膜电位检测JC-10发射出红色荧光,在线粒体内的存在形式为多聚体;细胞发生早期凋亡前,线粒体膜电位就出现下降情况,导致JC-10以单体形式存在于胞质内并发出绿色荧光。不同浓度的Ang-Ⅱ作用细胞12小时后,A、B、C、D组细胞的线粒体膜电位减低水平(%)为26.98±4.46、41.74±4.24、60.47±4.52、70.16±3.07。实验组较对照组线粒体膜电位下降明显,且差异有统计学意义(P0.01)。3各组细胞凋亡检测细胞凋亡显示,不同浓度的Ang-Ⅱ作用于细胞后,各组的早期凋亡率及晚期凋亡率分别为4.0%、1.8%,10.8%、2.9%,5.2%、8.2%,1.4%、15%。实验组B组的早期凋亡率高于A组,随着Ang-Ⅱ浓度的增加早期凋亡减少,晚期凋亡增加。结论:1 Ang-Ⅱ下调HUVECs TFAM表达量;2 Ang-Ⅱ增加线粒体膜电位的下降率;3 Ang-Ⅱ增加细胞的凋亡率。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.5

【参考文献】