趋化因子CCL2参与调控血小板活化及动脉血栓形成的相关研究

发布时间：2018-11-06 16:10

【摘要】：研究背景和目的急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病中最危重的类型,也是心血管疾病致死的头号杀手。及早明确AMI的诊断,迅速恢复堵塞的冠脉血流,挽救缺血的心肌至关重要。近年来,经皮冠脉介入治疗后,长期的抗血小板治疗已成为AMI的主要治疗手段之一。氯吡格雷和阿司匹林是常用的抗血小板药物。然而,越来越多的临床研究表明,常规应用抗血小板药物,甚至加大服药剂量或更换新型抗血小板药物替格瑞洛后,仍有一部分患者出现氯吡格雷抵抗或残余血小板高反应。这部分患者发生不良心血管事件的风险也明显增加。因此,寻找参与残余血小板聚集和活化且与患者预后相关的关键调控分子及信号通路是亟待解决的问题。CC趋化因子配体2(chemokine C-C motif 2,CCL2),又称单核细胞趋化蛋白1,是炎症反应中的启动因子,通过正反馈作用诱导其它炎性介质的产生和释放,加速动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的进展。有研究表明,血浆中CCL2高表达的急性冠脉综合征患者发生心血管终点事件的风险明显高于CCL2低表达的患者。我们前期的研究发现,CCL2在ST段抬高型心肌梗死(ST elevation myocardial infarction,STEMI)患者血浆中和血小板内的表达均明显高于对照组。CCR2是CCL2的特异性受体,是含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体。CCL2通过与CCR2结合后在AS及AMI发展的多个阶段如脂质条纹形成、斑块破裂、血栓形成中均发挥作用。然而,CCL2是否通过影响残余血小板的聚集和活化而参与动脉血栓形成,以及具体通过何种机制调控血小板,目前未见相关报道。基于上述研究背景,我们在本研究中首先探讨了服用替格瑞洛的STEMI患者血浆中CCL2表达的差异及其与残余血小板聚集率(residual platelet agglutination,RPA)的相关性,患者血小板中CCL2和CCR2的表达差异,以及血浆中CCL2水平与患者预后的相关性。其次分别以健康志愿者及小鼠为研究对象,应用蛋白芯片筛选并用Western Blot验证了CCL2对血小板中信号通路的调控。最后探讨了CCL2对小鼠血小板聚集、颗粒分泌和动脉血栓形成的影响。以明确CCL2是否参与残余血小板的活化及其具体调控机制,并验证CCL2是否参与了动脉血栓形成,为AMI等血栓性疾病的研究提供新思路。研究方法和结果1 CCL2参与STEMI患者残余血小板活化并与患者1年内发生主要心脑血管不良事件(major adverse cardiac and cerebral events,MACCE)独立相关。1)本部分共入选420例STEMI患者。采集80例服用替格瑞洛STEMI患者临床基线资料,光比浊法检测患者服药后不同时间点(2 h、4 h、6 h)的RPA并分组,比较残余血小板正常反应组(正常反应组)和残余血小板高反应组(高反应组)患者临床基线资料。各指标在正常反应组和高反应组之间比较均无统计学差异(P0.05)。服药后2h、4 h、6 h的残余血小板高反应比例分别为43.8%、28.8%、17.5%。应用Verifynow法检测患者服药后2 h、4 h、6h的P2Y12反应单位并分组,残余血小板高反应比例分别为34.8%、24.6%、14.3%。2)按照RPA结果分组,应用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA)检测正常反应组和高反应组患者血浆中CCL2浓度。结果发现:服药后不同时间点高反应组患者血浆中CCL2浓度(2 h:209.72±84.09 pg/ml;4 h:195.54±63.66 pg/ml;6 h:184.29±56.74 pg/ml)均明显高于正常反应组患者(2 h:167.52±36.92 pg/ml;4 h:160.63±42.31 pg/ml;6 h:152.43±42.48 pg/ml,P0.01或P0.05)。将患者服药后不同时间点的RPA与各时间点相应的血浆中CCL2浓度进行Pearson相关分析。结果发现:服药后2h、4h、6h患者的RPA值与血浆中CCL2浓度之间均存在线性关系(r=0.474,r=0.622,r=0.425,P0.01)。3)根据患者服用替格瑞洛后2 h的RPA值分组,选择正常反应组患者和高反应组患者各5例。应用Western Blot方法检测正常反应组和高反应组患者血小板中CCL2和CCR2表达。结果发现:高反应组患者血小板中CCL2及CCR2的表达均明显高于正常反应组(P0.01)。4)应用ELISA检测入选的全部420例STEMI患者入院即刻血浆中CCL2浓度,并对全部患者进行1年随访,比较发生MACCE与未发生MACCE患者血浆中CCL2浓度的差异。结果发现:1年内总体MACCE发生率为8.8%(37/420)。发生MACCE的STEMI患者血浆中CCL2浓度(244.56±105.85 pg/ml)明显高于未发生MACCE的患者(190.65±50.72 pg/ml,P0.01);其中发生全因死亡、心衰、脑梗塞、再发心梗的患者血浆中CCL2浓度(237.39±107.79 pg/ml、267.39±160.56 pg/ml、254.90±91.40 pg/ml、240.38±90.13 pg/ml)均明显高于未发生MACCE患者(P0.01或P0.05);24 h及24h-90 d发生MACCE患者血浆中CCL2浓度(269.83±115.27 pg/ml、251.25±132.74 pg/ml)明显高于未发生MACCE患者(P0.01)。5)按照420例STEMI患者血浆中CCL2的中位数浓度分组,比较两组患者临床基线资料和MACCE发生率。应用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析,Cox生存回归分析血浆中CCL2浓度与MACCE之间的相关关系。结果发现:血浆中CCL2的中位数浓度为179.89 pg/ml,CCL2浓度179.89 pg/ml的患者年龄、总体MACCE发生率及脑梗塞的发生率明显高于CCL2浓度≤179.89 pg/ml的患者(P=0.000,P=0.009,P=0.030)。血浆中CCL2浓度与患者1年内发生的MACCE独立相关(HR=1.008,P=0.000)。2 CCL2因子可以通过血小板内P38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)-热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)信号通路调控血小板。1)本部分入选20例健康志愿者。收集8例健康志愿者血小板,应用CCL2因子(1000 ng/ml)刺激其中4例志愿者的血小板,另外4例志愿者的血小板作为对照。通过蛋白芯片检测经CCL2因子刺激的血小板内发生磷酸化变化的激酶。接下来,收集入选的20例健康志愿者的血小板,应用CCL2因子(1000 ng/ml)刺激人血小板;或者分别应用CCL2中和抗体(50μg/ml)、CCR2拮抗剂RS 201895(10μM)、P38MAPK信号通路抑制剂SB 203580(10μM)预处理后,再应用CCL2因子刺激血小板。通过Western Blot方法检测芯片筛选的激酶磷酸化变化。结果发现:蛋白芯片共筛选出12种激酶磷酸化位点的磷酸化表达明显升高(P0.05),并且通过Western Blot验证了CCL2因子刺激后血小板内P38MAPK(T180/Y182)和HSP27(S78/S82)的磷酸化表达明显高于对照组(P0.01),这种作用可以分别被CCL2中和抗体、RS 201895或SB203580抑制(P0.01)。2)选取野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠各10只,应用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP,10μM)或者胶原(5μg/ml)刺激小鼠血小板,通过Western Blot方法检测野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠血小板内P38MAPK(T180/Y182)和HSP27(S78/S82)的磷酸化变化。结果发现:无论是ADP或者胶原诱导后,CCL2-/-小鼠血小板内P38MAPK和HSP27的磷酸化水平均明显低于野生型C57小鼠(P0.05)。3 CCL2参与小鼠血小板聚集、颗粒分泌和动脉血栓形成。1)选取野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠各10只,应用ADP或胶原刺激血小板,光比浊法检测野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠血小板聚集率。结果发现:经ADP(10μM、20μM)体外刺激后,CCL2-/-小鼠血小板聚集率均明显低于野生型C57小鼠(P0.05)。经胶原(2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)体外刺激后,CCL2-/-小鼠血小板聚集率均明显低于野生型C57小鼠(P0.05)。2)选取野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠各10只,应用ADP或胶原刺激血小板,ELISA检测野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠血小板颗粒分泌CD40L。结果发现:经不同浓度的ADP或胶原体外刺激后,CCL2-/-小鼠血小板颗粒分泌CD40L均较野生型C57小鼠明显降低(P0.05)。3)应用ADP或胶原刺激血小板后,ELISA检测野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠血小板颗粒分泌PF4。结果发现:经不同浓度的ADP或胶原体外刺激后,CCL2-/-小鼠血小板颗粒分泌PF4均较野生型C57小鼠明显降低(P0.05)。4)应用血细胞分析仪检测小鼠血液中血小板和白细胞计数。结果发现:CCL2-/-小鼠和野生型C57小鼠血液中血小板和白细胞计数无明显差异(P0.05)。5)应用手术刀在距离小鼠尾尖2 mm处剪断小鼠鼠尾,观察野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠平均鼠尾出血时间。结果发现:CCL2-/-小鼠鼠尾平均出血时间(9.55±3.36min)较野生型C57小鼠明显延长(7.27±2.67 min,P0.05)。6)应用凝血酶(1 U/ml)刺激小鼠富含血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP),观察野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠血凝块形成后的回缩。结果发现:凝血酶刺激小鼠PRP后30 min、60 min、120 min,CCL2-/-小鼠血凝块回缩均较野生型C57小鼠缓慢(P0.05)。7)应用10%三氯化铁外敷小鼠颈总动脉外膜,制备小鼠颈总动脉血栓模型。应用小动物超声探头监测小鼠颈总动脉血流变化,观察野生型C57小鼠和CCL2-/-小鼠颈总动脉闭合时间。结果发现:CCL2-/-小鼠颈总动脉平均闭合时间(13.01±6.21 min)较野生型C57小鼠明显延长(9.20±3.32 min,P0.05)。结论本课题初步揭示了CCL2参与残余血小板活化并且可以通过血小板内P38MAPK-HSP27信号通路调控血小板,在动物水平阐述了CCL2参与血小板的聚集、颗粒分泌和动脉血栓形成,不仅为AMI患者发生残余血小板活化和聚集提供了干预靶点,而且为AMI等血栓性疾病的防治提供了新的策略和方法。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R542.22
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本文编号：2314787