经血源性子宫内膜干细胞生物学特性及其成心肌样细胞分化研究

发布时间：2018-12-09 07:58

【摘要】：背景近年来,心血管疾病发病率逐年升高,而基于成体干细胞治疗心脏疾病的基础研究为临床应用带来新的契机。经血源性子宫内膜干细胞(Menstrual blood-derived Endometrial Stem Cells,Men ESC)具有干细胞特有的多向分化潜能,在特定诱导条件下可向心肌、神经、肝脏、胰腺、肺、骨、脂肪样细胞等分化。因此,在深入研究Men ESC生物学特性的基础上,筛选安全高效的成体干细胞成心肌分化诱导剂,为Men ESC在心脏疾病治疗中的应用提供理论支持。目的1. 深入分析经血源性子宫内膜干细胞生物学特性。2.明确样本存储时间对经血源性子宫内膜干细胞生物学特性的影响。3.筛选安全高效的经血源性子宫内膜干细胞成心肌分化的诱导剂。方法1. 月经杯收集健康女性志愿者(23-40岁)经血样品15 m L,与等量样品稀释保存液混合(含1%的青链霉素混合液、4%的0.25 mg/m L两性霉素B、2%的15 g/L EDTA-Na_2),4oC储存,并于48 h内进行原代细胞的分离提取。MTT法和流式细胞仪检测不同年龄志愿者经血样本中分离的Men ESC第3、9和18代(P3、P9及P18代)细胞增殖活性和成体干细胞表面标志的表达;将P3代Men ESC和小鼠嗜铬细胞瘤细胞株PC12注射入裸鼠皮下,检测Men ESC的致瘤性;将Di I标记的Men ESC经小鼠尾静脉注射72 h后取出肝、脾、肺和肾,经4%多聚甲醛固定,常规包埋后冰冻切片观察Men ESC在各器官分布。2.收集志愿者经血样本,同一经血样本平均分为三份,4oC储存6 h、24 h及72 h后采用密度梯度离心法分离培养Men ESC,HE染色及结晶紫染色法观察原代细胞形态及克隆形成;待培养至P3代时进行成脂成骨诱导和染色,MTT法检测增殖活性,流式细胞分析仪检测成体干细胞表面标志物表达。3.通过MTT法和划痕实验检测淫羊藿苷(Icariin,ICA)、丹酚酸B(salvianolic acid B Sal B)对P3代Men ESC增殖和迁移活性的影响;RT-PCR检测ICA、5氮杂胞苷(5azacytidine 5aza C)诱导前后心肌特异性转录调控因子MEF-2C、Nkx2.5、GATA4以及心肌特异性标志物心房钠尿肽(h ANP)、肌钙蛋白I(c Tn I)、肌钙蛋白T(c Tn T)的基因表达水平;最后进一步利用免疫细胞荧光的方法检测ICA、5aza C诱导后细胞中c Tn T在蛋白质水平的表达变化。结果1. 所分离培养的Men ESC阳性表达成体干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,阴性表达造血细胞标志表面标志物CD45和CD34,并且阳性表达HLA-ABC,阴性表达HLA-DR;供体年龄和细胞传代次数对Men ESC的增殖能力影响呈负相关。细胞随着供体年龄和传代次数的增加对Men ESC成脂分化没有明显影响。裸鼠接种PC12细胞一周后可明显观察到瘤体形成,生存期不超过12周;而接种Men ESC的裸鼠至12周后仍未观察到瘤体形成;Di I标记的Men ESC经尾静脉注射72 h后,主要滞留在肺脏和肝脏,少数出现在脾脏和肾脏。2.经血样本体外4oC保存6 h、24 h及72 h后,所分离获得的三组原代Men ESC培养7 d后,HE染色结果显示多数细胞呈长而扁平的梭形,细胞集落成旋涡状生长,形态均一,排列较为整齐,结晶紫染色后均可见明显细胞克隆。且获得的Men ESC培养相同时间后检测其细胞数量各组之间没有明显差异。三组P3代Men ESC经成脂或成骨诱导21 d后,均可见明显的脂滴和钙沉淀;在培养3 d、5 d及7 d后MTT法检测其增殖活性,分析表明三组细胞的增殖活性无统计学差异。流式分析结果表明:CD29、CD44、CD73、CD90及CD105五种常用成体干细胞表面标志物,在上述三组P3代Men ESC上的阳性表达率均高于95%,且各组表达无明显差异。3.ICA在浓度为10~(-6) mol/L和10~(-7 )mol/L时对Men ESC增殖和迁移无明显影响;而Sal B对Men ESC增殖和迁移均有抑制作用,因此选用ICA为理想的诱导Men ESC成心肌分化的诱导剂。进一步RT-PCR结果显示经ICA、5aza C诱导后的Men ESC均能显著上调MEF-2C、Nkx2.5、GATA4、h ANP、c Tn I及c Tn T基因的表达,而最终的免疫荧光结果也证实ICA诱导后的Men ESC阳性表达c Tn T。结论1. 所分离得到的Men ESC符合对成体干细胞的鉴定标准,进一步明确了Men ESC的生物学特性。2.从体外4oC存储72 h内经血样本中均可成功分离获得Men ESC,且对所分离获得的Men ESC生物学特性没有明显影响。3.ICA在不影响Men ESC增殖和迁移活性的基础上促进其成心肌样细胞分化。
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【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

【参考文献】