PKM2在重型再生障碍性贫血髓系树突状细胞功能激活中的作用研究

发布时间：2018-12-12 04:44

【摘要】：目的通过研究重型再生障碍性贫血(Severe aplastic animia,SAA)患者髓系树突状细胞(myeloid dendritic cell,m DC)内丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase M2,PKM2)表达水平,及其对m DC和下游效应T细胞的影响,在细胞和分子水平上探讨PKM2控制m DC的过度免疫反应、维持免疫稳态及调控SAA自身免疫状态的机制。通过SAA小鼠模型分析不同免疫抑制剂对PKM2和m DC细胞功能的影响,为研究细胞代谢在机体免疫中的作用提供新的思路,并为开展针对髓系树突状细胞的靶向治疗研究提供理论依据。方法实验对象选取天津医科大学总医院自2014年4月至2016年10月收入院的初治SAA患者、经免疫抑制治疗后缓解的SAA患者,以及健康志愿者。SAA小鼠模型选用C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠的子一代CB6F1作为受鼠(品系编码:303,8周龄,SPF级),C57BL/6小鼠作为淋巴细胞供鼠。所有小鼠均采购自北京维通利华实验动物技术有限公司,由中国医学科学院放射医学研究所动物中心代为饲养。第一部分检测SAA患者体内PKM2水平。选取15例SAA初治患者、15例SAA恢复期患者、及26名正常对照,采用流式细胞仪(FACS)、q RT-PCR及Western技术检测SAA患者外周血及骨髓m DC细胞内PKM2蛋白及m RNA的表达水平,并与正常人对比。同期检测上述SAA患者中性粒细胞计数、网织红细胞计数、T亚群比值,及m DC细胞数量、功能、活化因子表达,将PKM2水平与之进行相关性分析。第二部分观察PKM2对SAA患者m DC细胞增殖、活化的影响。应用RNAi敲低SAA患者m DC细胞内的PKM2后,流式细胞术检测敲低前后m DC细胞共刺激分子CD80、CD86表达水平,使用荧光免疫微球检测m DC细胞摄取能力,扫描电子显微镜下观察m DC细胞形态的变化。第三部分观察PKM2对SAA患者m DC细胞激活CTL(CD8+T细胞)的影响。应用RNAi敲低SAA患者m DC细胞内的PKM2表达后,将m DC细胞与CD8+T细胞共培养,实时定量PCR技术检测CTL细胞穿孔素、颗粒酶m RNA表达水平,ELISA试剂盒检测混合培养上清IFN-γ浓度,流式细胞术检测CTL细胞凋亡水平。第四部分SAA小鼠模型分析PKM2对m DC细胞功能的影响。构建SAA小鼠模型,流式细胞术检测CD4+/CD8+比值、Treg比例;CTL细胞功能分子穿孔素、颗粒酶水平;m DC细胞的数量、活化因子表达、PKM2表达水平。使用环孢素A和FK506对AA小鼠进行给药干预,检测用药前后各组m DC细胞数量、活化因子表达、PKM2水平及对CTL激活作用;检测m DC细胞内葡萄糖消耗量、丙酮酸、ATP生成水平。结果第一部分流式细胞术检测初治组SAA患者m DC细胞内的PKM2水平(59.1±15.8)%高于缓解组(42.6±22.1)%和正常对照组(32.7±20.2)%。且PKM2表达水平与DC细胞比例呈正相关(=0.476;=0.0145),而与网织红细胞比例(=-0.209;=0.0305)、中性粒细胞绝对值(=-0.258;=0.0122)和T亚群比值(=-0.397;=0.0013)呈负相关。初治SAA患者m DC细胞内PKM2 m RNA表达水平(1.50±0.84)明显高于缓解组(0.81±0.24)和对照组(0.32±0.11)。Western技术检测初治组患者m DC细胞内PKM2蛋白水平也明显升高。而经过免疫抑制治疗后,m DC细胞内PKM2无论是基因水平还是蛋白水平都逐渐下降趋近于正常。第二部分扫描电子显微镜下观察可见,对照组SAA患者的m DC胞体较大,细胞形态不规则,细胞膜表面可见树突状或毛刺状的突起,突起数量较多且粗长。当PKM2-si RNA转染SAA患者的m DC后,细胞胞体表面变得光滑,趋于圆形,细胞膜向外伸出的树突回缩,数量减少,且树突细短。通过流式细胞术检测敲低组m DC细胞吞噬百分率(36.68±5.49)%显著低于对照组(44.31±4.83)%,相较于对照组,敲低组吞噬指数存在较明显的降低趋势。在敲低m DC内PKM2表达后,SAA患者m DC细胞内CD86的表达水平(41.89±5.54)%较敲低前(55.76±7.08)%明显减低(P0.05),CD80的表达水平有减低趋势。相关性分析显示SAA患者m DC内PKM2表达水平与CD86细胞比例呈明显正相关(=0.562;=0.0126),而与CD80表达水平无显著相关性(=0.054;0.05)。第三部分实时定量PCR技术检测PKM2-si RNA敲低组SAA患者CD8+T细胞内穿孔素m RNA表达水平(0.84±0.39)明显低于对照组(1.23±0.43),而颗粒酶m RNA的表达水平在PKM2-si RNA组与对照组之间差异无统计学意义。ELISA试剂盒检测混合培养上清发现,PKM2-si RNA敲低组SAA患者m DC细胞与CD8+T细胞混合培养上清IFN-γ浓度(134.2±25.1)pg/ml明显低于对照组(466.3±53.9)pg/ml。此外,相较于对照组(34.86±11.05)%,PKM2-si RNA组中CTL细胞的凋亡水平(51.12±14.96)%出现显著升高,差异具有统计学意义(P0.05)。第四部分成功构建小鼠SAA模型,流式细胞术检测发现Treg比例下降,CD4+/CD8+比值降低,CTL细胞功能分子穿孔素、颗粒酶表达增加;m DC细胞的共刺激分子因子CD86表达增加,m DC细胞内PKM2水平升高,且m DC细胞内PKM2水平与m DC和T细胞功能具有明显相关性。使用环孢素和FK506作为免疫抑制剂对AA小鼠进行干预后,小鼠外周血象逐渐恢复,m DC细胞和CD8+T细胞功能分子水平下降,m DC细胞内PKM2表达水平明显降低。m DC细胞内葡萄糖、丙酮酸、ATP生成水平较治疗前下降(P0.05)。结论1、初治SAA患者m DC细胞内PKM2蛋白和m RNA水平均明显过度表达,经过强化免疫抑制治疗(IST)可得到明显改善。m DC内PKM2水平与DC细胞水平呈正相关,与网织红细胞、ANC和T细胞亚群呈负相关。表明PKM2可能参与了SAA患者体内m DC细胞的活化过程,并且与疾病进展程度呈现相关性。2、使用RNAi技术敲低SAA患者m DC内PKM2表达后,m DC细胞树突数量减少,抗原摄取能力受损,共刺激分子CD80、CD86的表达降低,表明PKM2具备刺激m DC细胞增殖、活化的能力。3、PKM2能够通过m DC激活下游CTL细胞功能,使CTL功能分子表达水平升高,功能亢进,进而增强对靶细胞的杀伤作用。4、成功建立SAA小鼠模型,在动物实验中证实了PKM2对m DC细胞和T细胞的激活作用。SAA小鼠m DC细胞内的高PKM2表达促进了细胞的糖酵解代谢水平,为m DC细胞及下游T细胞增殖和活化创造了物质和能量条件,当使用免疫抑制剂后,m DC细胞糖酵解代谢水平出现整体下降趋势。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R556.5

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本文编号：2373933