【摘要】：研究背景:缺血-再灌注损伤是影响急性心梗溶栓术、血管形成术、体外循环等治疗疗效的瓶颈因素,导致这一损伤的重要原因之一是胞内钙超载,而胞内钙超载引起心肌损伤的机制并不十分清楚。文献报道,胞内钙超载诱发心肌产生挛缩,继而撕裂肌膜,加重胞外Ca2+内流,形成恶性循环,最终造成心脏功能障碍和细胞死亡。又有研究发现,钙反常导致的胞内钙超载可使离体细胞发生死亡。由于离体细胞不存在“挛缩性”损伤,提示其它机制参与钙超载诱导的心肌损伤。钙蛋白酶是一种存在于胞浆中的钙离子依赖的半胱氨酸蛋白酶,研究表明,钙超载时钙蛋白酶转位至肌膜并活化,钙蛋白酶水解α-胞衬蛋白(a-fodrin)、钠-钾泵(Na+/K+-ATPase,NKA)等分子,引起细胞结构与功能破坏,造成心肌损伤。由于挛缩导致胞外Ca2+内流,是加重钙超载的原因,因此,在钙超载引起的心肌损伤过程中钙蛋白酶与挛缩的关系亟待阐明。临床研究发现,心脏搭桥患者术后血清中Cl-的浓度增加幅度与房颤成正相关。基础研究也观察到,氯通道阻断剂NPPB和SITS都能减轻缺氧-复氧诱导的心肌细胞损伤。表明,氯离子跨膜转运异常是缺血心肌损伤的危险因素,然而,这一损伤作用是否与激活钙蛋白酶有关也不清楚,有待明确。研究目的:(1)探讨钙超载损伤时钙蛋白酶与挛缩的关系;(2)阐明钙蛋白酶是否参与Cl-引起的心肌损伤。研究方法:第一部分:探讨钙超载损伤时钙蛋白酶与挛缩的关系成年清洁级Spragure-Dawley(SD)雄性大鼠,肝素化处理,脱颈处死后,迅速摘取心脏,将主动脉根部置于Langendorff灌流系统上。观察药物对正常心脏的作用时,实验随机分组如下:1.正常对照组:采用正常Krebs-Henseleit(KH)液灌注;2.MDL28170对照组:10mmol/L MDL28170处理8分钟,之后恢复为正常KH液灌注;3.KB-R7943对照组:10mmol/L KB-R7943处理8分钟,之后恢复为正常KH液灌注。在3分钟钙反常实验中,实验随机分组如下:1.钙反常-3组:无钙液灌注3分钟,正常含钙KH液灌注30分钟;2.MDL28170+钙反常-3组:无钙处理之前1分钟、无钙期间、复钙灌注开始后前2分钟,给予10mmol/LMDL28170处理;3.KB-R7943+钙反常-3组:无钙处理之前1分钟、无钙期间、复钙灌注开始后前2分钟,给予10mmol/LKB-R7943处理。在5分钟钙反常实验中,实验随机分组如下:1.钙反常-5组:无钙液灌注5分钟,正常含钙KH液灌注30分钟;2.MDL28170+钙反常-5组:无钙处理之前1分钟、无钙液灌注5分钟期间、复钙灌注开始后前2分钟,给予10mmol/LMDL28170处理;3.KB-R7943+钙反常-5组:无钙处理之前1分钟、无钙液灌注5分钟期间、复钙灌注开始后前2分钟,给予10mmol/LKB-R7943处理。各组心脏的总灌流时间相同。实验全程记录左心室内压(LVP),左心室舒张末压(LVEDP),以LVEDP反映挛缩状态,左心室发展压(LVDP)反映左室收缩功能。灌流结束后行TTC染色,检测心肌损伤面积(n=6)。复钙后收集冠脉流出液用于检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌钙蛋白(Troponin I,Tn I)的含量(n=6);在心肌组织生化实验中,于复钙后2分钟剪取心肌组织,用于检测钙蛋白酶活性、膜转位以及其底物蛋白a-胞衬蛋白的降解(n=4)。第二部分:阐明钙蛋白酶是否参与Cl-介导的缺血-再灌注心肌损伤成年清洁级SD雄性大鼠,肝素化处理,脱颈处死后,迅速摘取心脏,将主动脉根部置于Langendorff灌流系统上。观察药物对正常心脏的作用时,实验随机分组如下:1.正常对照组:采用正常KH液灌注;2.药物对照组:分别用5mmol/L或10mmol/L NPPB与DIDS,或低氯灌注液(用葡萄糖酸置换Cl-,使KH液中的Cl-低至90 mmol/L)处理8分钟,之后恢复为正常KH液灌注;在缺血-再灌注实验中,实验随机分组如下:1.缺血-再灌注组:全心缺血处理45分钟,再灌注2小时;2.氯通道阻断剂或低氯处理组:在全心缺血之前3分钟,再灌注开始后前5分钟,分别给予5mmol/LNPPB、5mmol/L DIDS或低氯处理,其他处理同缺血-再灌注组;3.MDL28170处理组:在全心缺血之前3分钟、再灌注开始后前5分钟,给予10mmol/L MDL28170处理,其他处理同缺血-再灌注组。在钙反常模型实验中,实验随机分组如下:1.钙反常组:心脏依次灌注无钙液3分钟,正常KH液30分钟;2.氯通道阻断剂或低氯处理组:于无钙液灌注之前1分钟、无钙液灌注期间以及正常KH液灌注开始后前2分钟,分别给予5mmol/LNPPB,5mmol/L DIDS或低氯处理,其他处理同钙反常组。3.MDL28170处理组:于无钙液灌注之前1分钟、无钙液灌注期间以及正常KH液灌注开始后前2分钟,给予10mmol/LMDL28170处理,其他处理同钙反常组。各组心脏总灌流时间相同。实验全程记录LVP与LVEDP,以LVEDP和LVDP反映左室功能。实验结束时行TTC染色,测量心肌损伤面积(n=6),评价细胞凋亡变化:TUNEL染色和caspase-3活性检测(n=4)。收集复灌开始后前10分钟或复钙开始后前2分钟内的冠脉流出液,以检测乳酸脱氢酶含量(n=6)。在心肌组织生化实验中,于复灌后10分钟或复钙后2分钟剪取心肌组织,以检测钙蛋白酶膜转位和底物蛋白a-胞衬蛋白的降解(n=4)。研究结果第一部分:钙反常模型中钙蛋白和挛缩的关系1.实验结束时,与正常对照组相比,钙蛋白酶抑制剂MDL28170和钠-钙交换体抑制剂KB-R7943对正常心脏的心功能和心肌损伤面积没有影响。2.3分钟钙反常处理后,LVEDP显著抬升,LVDP消失;心肌组织几乎全部死亡、乳酸脱氢酶大量释放;冠脉流出液中肌钙蛋白I的含量显著增加;钙蛋白酶活性明显增强,膜转位增加,底物蛋白a-胞衬蛋白降解增多。3.与3分钟钙反常组相比,MDL28170未能降低钙反常处理后的LVEDP,但显著减小心肌损伤面积,减少乳酸脱氢酶的释放,改善LVDP,并降低钙蛋白酶活性,抑制膜转位及a-胞衬蛋白降解的降解。KB-R7943也减弱钙蛋白酶活性,但与MDL28170不同,KB-R7943显著降低LVEDP,改善LVDP,同时提高细胞存活作用显著强于MDL28170。4.与3分钟的钙反常相比,5分钟钙反常组的LVEDP稍有降低,差异存在显著性,LVDP、心肌损伤面积、乳酸脱氢酶的释放无明显变化;钙蛋白酶的活性增强,a-胞衬蛋白的降解增加。5.在5分钟钙反常模型中,KB-R7943和MDL28170均不能降低LVEDP,不能改善LVDP,但二者仍可降低钙蛋白酶的活性、减少膜转位及a-胞衬蛋白的降解,减小损伤面积、减少乳酸脱氢酶的释放。6.KB-R7943显著减少3分钟和5分钟钙反常处理中冠脉流出液肌钙蛋白I的含量,而MDL28170则无此作用。第二部分:钙蛋白酶在Cl-诱导的心肌损伤中的作用1.与正常灌注组相比,10mmol/L NPPB增加细胞死亡,而10mmol/LDIDS处理可引起不可逆的LVEDP抬升。当浓度降低为5mmol/L时,NPPB和DIDS的不良作用消失。2.与缺血-再灌注组相比,5mmol/L NPPB、5mmol/L DIDS、低氯处理均显著减小心肌损伤面积、乳酸脱氢酶的释放,降低减少凋亡指数和caspase-3的活性,这些作用与钙蛋白酶抑制剂MDL28170的作用相似。心功能研究表明,DIDS和低氯处理显著降低LVEDP,NPPB也降低LVEDP,但无显著性差异,三种处理均可改善LVDP。3.与钙反常组相比,5mmol/L NPPB、5mmol/L DIDS和低氯处理均显著减小心肌损伤面积、乳酸脱氢酶的释放,降低凋亡指数和caspase-3的活性。这些作与钙蛋白酶抑制剂MDL28170的作用相似。心功能研究表明,三种处理均处理显著降低LVEDP,同时伴随LVDP的明显改善4.MDL28170可减少缺血-再灌注或钙反常引起的钙蛋白酶的膜转位,以及底物蛋白a-胞衬蛋白降解。与MDL28170的作用相似,5mmol/L NPPB、5mmol/L DIDS以及低氯处理不仅减少缺血-再灌注,还减少钙反常所致的钙蛋白酶膜转位,以及底物蛋白a-胞衬蛋白降解。研究结论1.研究表明:除挛缩外,钙蛋白酶的激活是钙超载致心肌损伤的重要环节;挛缩引发心脏功能障碍,而钙蛋白酶参与心肌死亡的发生。2.在心肌缺血-再灌注损伤中,氯跨膜转运异常将激活钙蛋白酶,引起心肌损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.2
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本文编号：
2384023
