【摘要】：病毒性心脏病(viral heart disease, VHD)是与病毒感染有关的一组心血管疾病,包括病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)和扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM),其最常见的感染原是柯萨奇病毒(coxsackie virusB,CVB)。据报道,由于病毒感染持续存在或自身免疫失稳等原因,少数患者可由VMC进展为慢性病毒性心肌炎和DCM。很多学者认为VMC和DCM实际上是同一种疾病的不同阶段。近期的研究表明心肌纤维化是VMC进展至DCM的重要原因,但其机制至今尚未能完全阐明。Th22细胞是一种新发现的CD4+T辅助细胞亚群,其特征是分泌白介素-22(interleukin-22, IL-22),而不分泌白介素-17、白介素-4或干扰素-Y(interferon-y, INF-y)等因子。近来的多项研究表明,分泌IL-22的Th22细胞参与了多种自身免疫性及感染性疾病发生和发展的病理生理机制。我们课题组前期的实验亦发现,Th22细胞及IL-22在病毒性心肌炎中起到了抗感染与抗病毒的作用。但Th22及其分泌的IL-22是否参与了VMC向DCM进展的过程?其在心肌纤维化的进程中究竟扮演着什么样的角色?又是通过哪些因子发挥作用的?目前知之甚少。为了解Th22及IL-22是否参与VMC向DCM进展的过程,阐明其在心肌纤维化中的作用,寻求治疗DCM的新思路和新靶点,本课题将应用BALB/c小鼠腹腔内注射CVB3病毒的方法建立VHD模型,进行以下的研究。第一部分：小鼠病毒性心脏病各阶段心肌纤维化相关指标的变化本部分包括以下两个方面的研究：1.小鼠病毒性心脏病模型的建立及心肌病理改变；2.小鼠病毒性心脏病各阶段纤维化相关指标变化。100只4周龄雄性BALB/c小鼠随机分为急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis, AVMC)组(n=20)、慢性病毒性心肌炎(chronic myocarditis)组(n=20)、DCM组(n=30)及对照组(n=30)。采用腹腔接种CVB3建立小鼠AVMC模型、慢性病毒性心肌炎模型及DCM模型,对照组小鼠腹腔注射等量的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)。各组小鼠在规定时点取血,分离血浆,无菌取心脏和脾。HE染色了解心肌病理组织学改变,Masson染色了解心肌纤维化程度,实时荧光定量PCR(real time RT-PCR)检测心肌组织纤维化相关指标Ⅰ型胶原A1 (collagen type Ⅰ-Al, COL1-A1)、Ⅲ型胶原A1 (collagen type Ⅲ-A1, COL3-A1)、基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase-9, MMP9)及金属蛋白酶组织抑制因子1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1) mRNA的表达；酶联免疫双夹心抗体法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清中纤维化相关蛋白的表达。大体标本显示AVMC小鼠心室大小无变化；慢性病毒性心肌炎小鼠心腔无明显扩大,但可见少量片状纤维化病灶；DCM小鼠左室腔明显扩大,室壁变薄。病理切片苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色显示AVMC小鼠心肌纤维断裂、心肌细胞变性坏死、间质有大量炎症性细胞浸润,有心肌纤维化发生,但仅局限在心肌坏死灶周边；慢性病毒性心肌炎小鼠无明显心肌纤维断裂,心肌内炎性细胞浸润减少,心肌间质纤维化明显；DCM小鼠心肌间质大量胶原异常增生,呈弥漫性分布而几无炎性细胞浸润,心肌间质纤维化较慢性期更为明显。心肌组织切片Masson染色显示,心肌纤维化程度进行性增加,各阶段胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF)的变化有显著性差异。同时外周血ELISA及心肌组织RT-PCR显示与同时点对照组相比,AVMC组、慢性病毒性心肌炎组及DCM组纤维化相关指标COL1-A1、COL3-A1、MMP9呈升高趋势,MMP9相关抑制因子TIMP-1呈降低趋势。结论：AVMC、慢性病毒性心肌炎及DCM造模成功,随VHD病情进展,心肌纤维化程度呈进行性加重。第二部分：Th22细胞及其分泌的相关细胞因子IL-22在VHD中的表达本部分包含以下两个方面的研究：1.小鼠VHD演变过程中Th22细胞亚群的变化趋势;2.小鼠VHD演变过程中Th22分泌的相关因子IL-22 IL-22受体(IL-22 receptor, IL-22R)的表达变化趋势。各组小鼠在规定时点无菌取血,分离血清,无菌取心脏和脾。流式细胞仪(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)检测小鼠脾Th22细胞数量百分比。ELISA检测血清中IL-22蛋白的表达；免疫组化检测小鼠心肌组织IL-22R表达水平。使用统计软件SPSS对各组小鼠脾脏Th22细胞与IL-22、IL-22R进行相关性分析。流式细胞计数结果显示,与同时点对照组小鼠相比,VHD小鼠Th22细胞百分比显著升高(AVMC期：4.64±2.35 vs. control 1.78±0.79;慢性病毒性心肌炎期：5.90±1.74 vs. control 1.50±0.44; DCM期：5.60±1.47 vs. control 1.75±0.30)。 ELISA结果显示,VHD小鼠血清IL-22蛋白含量较同时点对照组明显升高(AVMC期：18.07±3.22 vs. control 14.23±1.4 pg/ml;'慢性病毒性心肌炎期：23.66±2.93 vs. control 15.89±1.92 pg/ml; DCM期：23.48±4.95 vs.control 16.09±2.2 pg/ml)。免疫组化结果显示,VHD小鼠心肌组织IL-22R较同时点对照组明显升高(IL-22R IOD值在AVMC期：32.21±2.81×105 vs.control 6.30±1.03×105;慢性病毒性心肌炎期：30.65±6.76×105 vs. control5.15±0.99×105；DCM期：34.40±2.63×105 vs. control 5.48±1.53x105)。相关性分析显示,Th22细胞数量与IL-22 ± IL-22R呈正相关。结论：Th22细胞比例及其相关因子循环血清IL-22、心肌IL-22R蛋白表达在AVMC组、慢性病毒性心肌炎组及DCM组均较同时点对照组增高,且Th22细胞百分比与循环血清IL-22、心肌IL-22R蛋白表达存在正相关,提示Th22细胞及其相关因子参与了小鼠VHD的演变过程。第三部分：抗IL-22抗体对小鼠病毒性心肌炎心肌纤维化的干预作用该部分包含以下三个方面的研究：1.抗IL-22抗体(anti-IL-22 antibody, Anti-IL-22 Ab)对病毒性心肌炎小鼠Th22细胞、IL-22、IL-22R表达的影响；2.抗IL-22抗体对病毒性心肌炎小鼠及其心肌病理变化的影响；3.抗IL-22抗体对病毒性心肌炎小鼠心肌纤维化及其相关指标的影响。4周龄雄性BABL/c小鼠60只,随机分成week 2组(n=30)及week 12组(n=30),每组中又分成三个亚组：抗IL-22抗体组(Anti-IL-22 Ab组,n=10)、同型对照组(IgG组,n=10)、PBS组(n=10)。全部小鼠均腹腔注射CVB3病毒液,注射病毒当天定义为第0天。week 2组中Anti-IL-22 Ab、IgG和PBS亚组小鼠在第0天分别腹腔注射50μg Anti-IL-22 Ab、50μg同型对照IgG和50μg PBS; week 12组中的三个亚组存活小鼠尚需在第28天及第56天注射CVB病毒液,其三个亚组的存活小鼠需在第0天、第28天、第56天分别腹腔注射50μg Anti-IL-22 Ab、50μg同型对照IgG和50μgPBS。各组小鼠在规定时点取血,分离血清,无菌取心脏和脾。Masson染色了解心肌纤维化程度；流式细胞技术检测脾Th22亚群细胞数量；免疫组织化学检测小鼠心肌组织IL-22R表达水平；RT-PCR检测小鼠心肌组织中COL1-A1 COL3-A1、MMP9、TIMP-1 mRNA的表达；ELISA检测小鼠血浆中TL-22、COL1-A1、MMP9、TIMP-1的表达水平。结果显示,与注射同型对照IgG或PBS相比,不论在急性或慢性病毒性心肌炎期,Anti-IL-22 Ab可减少CVB3病毒感染小鼠脾脏Th22细胞、血清中IL-22水平及心肌中IL-22R的含量,增加小鼠的死亡率,升高心肌及血清中心肌纤维化相关指标的mRNA及蛋白水平,加剧小鼠心肌的纤维化程度,使抗体干预后慢性病毒性心肌炎期小鼠的心肌纤维化程度更趋于接近抗体未干预时的DCM期(CVF 0.30±0.07 vs.0.24±0.09, p0.05),加速心肌纤维化病程的进展。结论：通过Anti-IL-22 Ab的拮抗作用,我们可以观察到随着Th22细胞百分比、血清IL-22、心肌组织IL-22R的降低,AVMC及慢性病毒性心肌炎小鼠生存率明显降低,心肌纤维化进程加快,而且抗体干预后的小鼠在慢性病毒性心肌炎期的心肌纤维化程度已与未干预时的DCM期相当,与之相伴的是纤维化相关因子COL1-A1、COL3-A1、MMP9的增加及TIMP-1的降低。该结果提示分泌IL-22的Th22细胞通过对心肌纤维化相关因子的干预,在VHD进程中起到延缓心肌纤维化和保护心肌的作用。总之,分泌IL-22的Th22细胞是AVMC向慢性病毒性心肌炎甚至DCM发展过程中的重要细胞,它通过抑制纤维化相关指标,延缓心肌纤维化进程,发挥保护心肌的重要作用。本课题研究结果提示：CVB3导致的小鼠VHD模型中,随病情进展,心肌纤维化程度呈进行性加重。小鼠Th22细胞及其相关因子IL-22、IL-22R在AVMC、慢性病毒性心肌炎期及DCM期均较同时点对照组增高,且Th22细胞数与IL-22、IL-22R存在正相关,提示Th22细胞及其相关因子参与小鼠VMC向DCM演变的过程。分泌IL-22的Th22细胞是AVMC向慢性病毒性心肌炎甚至DCM发展过程中的重要细胞,它通过抑制纤维化相关指标,延缓心肌纤维化进程,发挥保护心肌的重要作用。本课题研究数据提示IL-22可能是通过作用于心肌纤维化达到延缓或阻止AVMC向慢性病毒性心肌炎甚至DCM发展的重要靶标。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541
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