【摘要】：缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)的临床治疗主要是通过恢复缺血部位的血流灌注,但却可能会对心肌组织造成更严重的损伤,即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。细胞内钙超载是心肌功能异常与I/R损伤的主要诱因。缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)是机体固有的一种强有力的内源性保护现象,指心肌经历反复短暂的亚致死性I/R损伤后,能够显著增强对随后长时间的严重缺血损伤耐受性的现象。IPC的保护作用同样存在于血管内皮细胞上,血管内皮细胞在血液和组织器官界面之间充当了重要的屏障,是心肌I/R损伤发生时的第一道防线。因此,研究IPC作用保护血管内皮细胞的健康完整可能有助于预防或减轻心肌细胞的缺血、I/R损伤。细胞微囊泡(microvesicles,MVs)是细胞发生激活或凋亡时产生释放到细胞外的一种膜性囊泡样物质,能通过携带生物活性物质来调节各种生命活动。那么IPC对心肌I/R损伤的有效保护能否通过释放保护性的MVs来介导呢?本实验利用体外缺氧预处理(hypoxia preconditioning,HPC)模拟体内IPC,细胞内钙超载损伤代表I/R损伤,研究HPC诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)释放的MVs对细胞内钙超载损伤H9c2心肌细胞的作用。目的:体外构建HUVECs的HPC模型,提取培养上清中的微囊泡(HUVECs derived microvesicles induced by hypoxia preconditioning,HPC-EMVs)。对分离得到的HPC-EMVs进行蛋白定量和形态学鉴定,探讨HPC-EMVs对正常和细胞内钙超载损伤H9c2心肌细胞的作用。方法:1.HUVECs细胞HPC模型的建立HUVECs以6×104的密度接种于96孔板中,培养24 h后,随机分为Control,H/R(hypoxia/reoxygenation)和HPC组。Control组正常培养,H/R组行缺氧12 h,复氧4 h培养,HPC组经历短期预缺氧/复氧后,再行长时间缺氧12 h,复氧4 h,采用MTT法检测细胞存活率,选择适宜的细胞种板密度、预缺氧/复氧时间、预缺氧/复氧使用缺氧液的p H值,使HPC组细胞存活率显著高于H/R组,建立HUVECs细胞的HPC模型。2.HPC-EMVs的分离提取与形态学鉴定采用超速离心的方法在HPC处理的培养上清液中收集HPC-EMVs,采用BCA法对HPC-EMVs进行蛋白定量,采用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)对其进行形态学鉴定。3.H9c2细胞内钙超载损伤模型的建立H9c2细胞以1×105个/m L密度接种于96孔板中,以不同浓度钙离子载体离子霉素(ionomycin)诱导细胞损伤并观察0.55μmol/L浓度ionomycin对H9c2细胞内钙超载的影响。H9c2细胞以1×105个/m L密度接种于直径35 mm的共聚焦小皿中,随机分组,以0.55μmol/L ionomycin避光处理50 min后,加入Fluo-3 AM荧光染料负载,应用激光共聚焦显微镜在488 nm波长的激发光激发下摄片。利用Image J软件对图像进行数据化分析,确定最适宜的ionomycin处理浓度,建立H9c2细胞钙超载损伤模型。4.HPC-EMVs对正常H9c2细胞的作用H9c2细胞分为Control组,10,30,60μg/m L HPC-EMVs处理组,共4组。Control组加入不含FBS的DMEM培养基;HPC-EMVs 10,30,60组分别加入10,30及60μg/m L的HPC-EMVs,共同培养4 h。通过MTT法检测细胞存活率。5.HPC-EMVs对细胞内钙超载H9c2细胞的作用H9c2细胞分为Control,0,10,30,60μg/m L HPC-EMVs处理组,共5组。Control组加入无FBS的DMEM培养基;HPC-EMVs处理组分别用0,10,30,60μg/m L HPC-EMVs预先孵育H9c2细胞4 h,再诱导细胞内钙超载损伤。首先Fluo-3 AM荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测60μg/m L HPC-EMVs组细胞内钙离子荧光强度,并通过MTT法检测细胞存活率,比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,采用Hoechst 33258染色从形态学观察H9c2细胞凋亡,分光光度法检测细胞中Caspase 3活性,Western blot法检测H9c2细胞中Bcl-2/Bax的表达。结果:1.成功建立HUVECs的HPC模型HUVECs以6×104的细胞密度种板,HPC组加入p H 6.8的缺氧液,通入95%N2-5%CO2混合气预缺氧通气10 min/复氧15min,再加入等量p H 5.8的缺氧液,然后通混合气平衡15min,缺氧12 h,复氧培养4 h后,与H/R组相比,HPC组存活率显著升高(93.9±6.9%vs 79.6±5.7%,P0.01),且模型稳定易操作,重复性较好。2.成功分离提取得到HPC-EMVs并进行形态学鉴定细胞培养上清经2,700 g,4℃,离心20 min除去细胞碎片,采用33,000 rpm,148 min,4℃超速离心得到HPC-EMVs。重悬后,HPC-EMVs蛋白定量结果为0.304±0.06μg/μL。透射电子显微镜观察到HPC-EMVs为直径100-1000 nm的膜性囊泡样结构,呈圆或椭圆形,有完整的包膜,单个分散或聚集成群。3.成功建立H9c2细胞内钙超载损伤模型与Control组相比,0.55μmol/L ionomycin能显著降低H9c2的存活率(63.2±4.7%vs 100±0%,P0.001)。选择0.55μmol/L ionomycin验证钙超载。与Control组相比,0.55μmol/L ionomycin作用H9c2细胞50 min,细胞内钙离子平均荧光强度有显著升高(38.57±0.83 a.u.vs 24.28±0.90 a.u.,P0.001)。4.HPC-EMVs对正常H9c2细胞的作用与Control组相比,10μg/m L HPC-EMVs对正常H9c2细胞存活率无明显影响(97.3±2.8%vs 100±0%),30,60μg/m L HPC-EMVs对正常H9c2细胞存活率有显著降低(91.9±1.4%,77.4±3.1%vs 100±0%,P0.001),且作用呈剂量依赖性。5.HPC-EMVs对细胞内钙超载损伤H9c2细胞的作用激光共聚焦显微镜摄片显示,与HPC-EMVs 0组相比,60μg/m L HPC-EMVs能显著降低细胞内钙离子荧光强度(30.96±1.19 a.u.vs 38.57±0.83 a.u.,P0.001),减轻细胞内钙超载。采用ionomycin造成H9c2细胞内钙超载,与HPC-EMVs 0组相比,10μg/m L HPC-EMVs对细胞存活率无明显影响(61.7±4.4%vs 63.2±4.7%),30,60μg/m L HPC-EMVs使细胞存活率显著升高(70.3±4.3%,74.4±5.6%vs 63.2±4.7%,P0.001)。HPC-EMVs 30和60组LDH漏出显著减少(157.24±16.51 U/L,145.01±5.86 U/L vs 178.93±12.86 U/L,P0.05,P0.001)。Hoechst 33258染色结果观察到,HPC-EMVs处理组内,随HPC-EMVs浓度增加,细胞碎裂情况减少,核凝聚减轻。HPC-EMVs 30,60组Caspase 3活性显著降低(314.27±9.53 U/μg,304.25±10.49 U/μg vs 365.44±9.54 U/μg,P0.001),而HPC-EMVs 10组略有降低但无统计学差异(354.97±10.48 U/μg vs 365.44±9.54 U/μg)。Western blot结果显示,随HPC-EMVs浓度的增加,各组Bcl-2蛋白表达逐渐增多,Bax蛋白表达逐渐减少,两者比值升高,其中HPC-EMVs 60组Bcl-2/Bax显著升高。结论:1.本实验成功建立了HUVECs的HPC模型。2.透射电镜观察超速离心得到沉淀物为直径100-1000 nm的膜性囊泡样结构,证实利用HPC处理HUVECs分离提取得到的膜性囊泡样物质确为HPC-EMVs。3.成功建立H9c2细胞内钙超载损伤模型。0.55μmol/L ionomycin能诱导H9c2细胞内钙离子平均荧光强度显著升高,且细胞损伤程度适中。4.30,60μg/m L HPC-EMVs对正常H9c2细胞存活产生影响,降低H9c2细胞存活率,其中以60μg/m L HPC-EMVs作用最显著。5.60μg/m L HPC-EMVs能显著减轻H9c2细胞内钙超载。对细胞内钙超载的H9c2细胞,30,60μg/m L HPC-EMVs使细胞存活率显著升高;LDH漏出明显减少,Caspase 3活性显著降低。Hoechst 33258染色观察到HPC-EMVs能剂量依赖性的减轻细胞内钙超载H9c2细胞核碎裂和核聚集。60μg/m L HPC-EMVs能显著增加细胞内钙超载H9c2细胞Bcl-2/Bax蛋白的表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54
【参考文献】
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1 肖桂凤;细胞钙超载模型的建立及在中药钙拮抗药效评价中的应用[D];浙江大学;2005年
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本文编号：
2408587
