抑制CapG基因预防低氧性肺动脉高压的研究

发布时间：2019-01-21 10:18

【摘要】：背景和目的：低氧性肺动脉高压(HPH)由急性或慢性肺泡缺氧所致,能导致右心肥大及右心功能不全。肺动脉高压发病机制中的研究热点是肺血管重塑,主要表现为肺动脉壁结构细胞的异常增殖和迁移所致的肺动脉壁增厚及远端无肌细动脉的肌化。体外研究显示,低氧可通过各种介质刺激肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的异常增殖和迁移,促进肺血管重塑的发生。在前期研究中,本课题组利用蛋白组学技术比较分析常氧和低氧处理后的人PASMCs的蛋白表达谱,发现低氧时PASMCs的凝溶胶样肌动蛋白加帽蛋白(CapG)的表达明显上调,当采用小干扰RNA的方法抑制CapG的表达后,低氧诱导PASMCs的迁移作用明显降低。这提示CapG在低氧性肺血管重塑的发生中可能起了重要的作用。基于以上分析,我们推测局部抑制CapG能有效的抑制肺血管重塑,具有预防HPH的潜力。我们在体外条件下探讨CapG对大鼠原代PASMCs迁移、增殖、凋亡、细胞周期的影响,在体内实验中研究CapG在HPH大鼠模型低氧性肺血管重塑和肺动脉压力升高过程中产生的作用。这些研究工作拓展了CapG的功能,可望为HPH的发病机制研究及其防治提供新的思路。方法：1、采用组织贴块法和差速贴壁法分离大鼠原代PASMCs,采用免疫荧光法鉴定PASMCs及检测CapG在PASMCs的分布。将PASMCs经不同时间段(Oh,6h, 12h,24h,48h)低氧(1%02)干预,用RT-PCR和Western blot的方法检测PASMCs中CapG在mRNA和蛋白水平的表达变化。2、设计并构建干扰CapG基因的小干扰RNA si-CapG及对照小干扰RNA si-NC.大鼠PASMCs分为常氧si-NC组、常氧si-CapG组、低氧si-NC组、低氧si-CapG组,PASMCs转染si-CapG或si-NC 48h之后,分别进行常氧(21%02)或低氧(1%02)培养。用Transwell小室法检测抑制CapG基因对PASMCs迁移能力的影响,用CCK-8法检测抑制CapG基因对PASMCs细胞活力的影响,用EdU法检测抑制CapG基因对PASMCs增殖能力的影响,用流式细胞术检测抑制CapG基因对PASMCs凋亡、细胞周期的影响。3、设计并构建干扰CapG基因的慢病毒载体Lenti-CapG及对照慢病毒载体Lenti-NC.大鼠分为常氧对照组(n=8)、低氧对照组(n=6)、低氧干扰组(n=6)。将Lenti-CapG或Lenti-NC经气道内滴注的方式感染大鼠,2周后将大鼠分别进行常氧(21%02)或低氧(10%02)饲养。4周后检测CapG在各组大鼠肺组织以及PASMCs的表达,测定各组大鼠右心室收缩压(RVSP)、右心室肥厚指数(RVHI).肺小动脉管壁厚度占管径的百分比(WT%)、肺无肌小动脉的肌化程度。结果：1、成功分离、培养并鉴定大鼠原代PASMCs.免疫荧光法提示CapG在PASMCs的细胞核和细胞质内都有分布。大鼠原代PASMCs的CapG mRNA和蛋白表达量随低氧培养时间增加而逐渐升高,一直持续至48 h。2、构建的si-CapG能明显下调PASMCs的CapG表达。体外实验结果显示,低氧能促进PASMCs迁移、提高细胞活性和促进细胞增殖,但是低氧诱导了PASMCs凋亡却促进细胞周期G1/S期转换。不管是常氧还是低氧条件下,与si-NC组相比,si-CapG组的PASMCs迁移能力下降、细胞活性和增殖能力下降、细胞早期凋亡和晚期凋亡增多且出现了细胞周期(S+G2/M)期比例下降。3、构建的Lenti-CapG能明显下调PASMCs的CapG表达。通过气道内滴注的方式可以将慢病毒高效地整合到肺组织局部,在肺小动脉壁和支气管管壁表达尤为明显。HPH大鼠模型实验结果显示,低氧对照组的RVSP、RVHI明显高于常氧对照组,而低氧干扰组的RVSP、RVHI较低氧对照组下降。低氧对照组的WT%明显高于常氧对照组、肺无肌小动脉的肌化程度升高,低氧干扰组与低氧对照组相比WT%降低、肺无肌小动脉的肌化程度下降。结论：低氧可诱导大鼠原代PASMCs中CapG的表达上调,抑制CapG基因后,PASMCs的迁移能力下降、细胞活性和增殖能力降低、细胞凋亡增多、细胞周期(S+G2/M)期比例下降。以慢病毒为载体,通过气道内滴注的途径,将干扰CapG基因表达的Lenti-CapG感染至大鼠肺组织,可以在肺组织局部高效表达慢病毒。在低氧诱导肺动脉高压之前经气道滴注Lenti-CapG,可以缓解肺动脉压力的升高、肺血管的重塑以及右心室的肥厚。提示CapG有可能成为防治HPH的潜在靶标。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R544.1

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本文编号：2412560