高迁移率族蛋白1（HMGB1）和姜黄素对内皮—间质细胞转化的作用及其机制研究

发布时间：2019-02-18 22:56

【摘要】：背景心力衰竭严重危害着人类的健康,心肌纤维化是终末期心力衰竭的共同病理特点,心肌纤维化已成为心力衰竭治疗的重要靶点。异常内皮-间质细胞转化(Endothelial-mesenchymal transition,EndMT)是心肌纤维化发生发展的关键机制之一,因此通过深入研究EndMT的机制并探索延缓甚至逆转EndMT的有效药物,可能为防治心力衰竭提供潜在的新型治疗药物。脂多糖可激活TLR4诱导EndMT促进纤维化发展。高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)是 TLR4 的配体,且研究证明 HMGB1 通过 TGF-β1/Smad2/3通路诱导EMT促进肺纤维化。虽没有直接证据表明HMGB1通过TGF-β1/Smad2/3通路诱导EndMT,但EndMT是EMT的特殊类型,因此,同样作为TLR4 配体的 HMGB1 可能通过 TLR4/NF-κB/TGF-β1/Smad2/3 通路诱导 EndMT促进心肌纤维化。研究表明姜黄素具有抗纤维化的作用,但姜黄素是否能够通过抑制EndMT抗心肌纤维化尚不明确。方法分三部分:(1)查阅文献初定候选浓度梯度,CCK8和Western blot确定姜黄素、AngⅡ、HMGB1药物作用浓度。(2)初步探索姜黄素对AngⅡ诱导EndMT的影响及其机制;分组:1.对照组;2.AngⅡ组;3.姜黄素+AngⅡ组;4.氯沙坦+ AngⅡ组;显微镜观察细胞形态改变;划痕实验检测各组迁移能力;Western blot 检测各组 VE-cadherin,α-SMA,TGF-β1 表达。(3)进一步研究姜黄素对HMGB1诱导EndMT的影响及其机制:分组:1.对照组;2.HMGB1组;3.姜黄素+HMGB1 组;4.CLI-095+HMGB1 组;5.CLI-095(TLR4 特异性抑制剂)组;各组作用5天显微镜观察细胞形态变化;各组作用24小时,划痕实验检测各组迁移能力,RT-QPCR 检测各组 VE-cadherin,α-SMA,TGF-β1,collagen Ⅰ和 collagen Ⅲ的 mRNA 表达,Western blot 检测各组 VE-cadherin,α-SMA,TLR4,TGF-β1,collagen Ⅰ,Phospho-NF-κB p65,Phospho-Smad2/3 蛋白表达差异;免疫荧光显示各组VE-cadherin,α-SMA表达情况。结果第一部分初筛作用浓度姜黄素为12.5μM,AngⅡ为1μM,HMGB1为800ng/ml。第二部分(1)HUVECs经AngⅡ刺激形态改变,长梭形样细胞增多;姜黄素和氯沙坦可维持内皮细胞铺路石样形态。(2)相比对照组,AngⅡ促进HUVECs的迁移(P0.05);相对AngⅡ组,加入姜黄素和氯沙坦抑制HUVECs 的迁移(P均 0.05);(3)AngⅡ可诱导 EndMT,AngⅡ刺激后 VE-cadherin表达减弱(P=0.003),而α-SMA和TGF-β1的表达都明显增强(P均0.01),姜黄素和氯沙坦使VE-cadherin表达明显增加,而α-SMA和TGF-β1的表达均明显下调。第三部分(1)HUVECs经HMGB1刺激后可见长梭形样细胞增多;姜黄素和TLR4特异性抑制剂CLI-095可维持内皮细胞铺路石样形态。(2)与对照组相比,HMGB1促进HUVECs的迁移(P0.05);相对HMGB1组,加入姜黄素和CLI-095抑制HUVECs的迁移(P均0.05);(3)RT-QPCR结果:相比对照组,HMGB1 组 VE-cadherin mRNA 表达减弱(P0.05),而 α-SMA,collagen Ⅰ,collagen Ⅲ和 TGF-βl 的 mRNA 表达均明显升高(P 均0.01);与HMGB1 组相比,姜黄素 + HMGB1 组和 CLI-095+HMGB1 组的 VE-cadherin mRNA 表达明显增加(P 均0.05),而 α-SMA,collagen Ⅰ 和 TGF-βl 的 mRNA表达均降低(P均0.05);(4)Western blot结果:与对照组相比,HMGB1刺激后 VE-cadherin 蛋白表达减弱(P0.05),而 α-SMA,collagen Ⅰ,Phospho-NF-κB,TGF-β1 和 Phospho-Smad2/3 的蛋白表达都升高(P 均0.01);与 HMGB1 组相比,姜黄素 + HMGB1 组和 CLI-095+HMGB1 组的 VE-cadherin表达明显增加(P 均0.05),而 α-SMA,collagen I,Phospho-NF-κB,TGF-β1和Phospho-Smad2/3的蛋白表达均降低(P均0.05);(5)免疫荧光显示:HMGB1组VE-cadherin蛋白(红色)荧光明显减弱,而α-SMA蛋白(绿色)荧光表达都增强;与HMGB1组相比,姜黄素和CLI-095使VE-cadherin(红色)荧光增加,而α-SMA绿色荧光显示不明显。结论1.姜黄素通过下调TGF-β1表达抑制由AngⅡ诱导的EndMT。2.HMGB1 通过激活 TLR4/NF-KB/TGF-β1/Smad2/3 信号通路诱导 EndMT,促进胶原蛋白的分泌。3.姜黄素和CLI-095可通过下调TLR4/NF-κB/TGF-β1/Smad2/3信号通路抑制HMGB1诱导的EndMT,减少胶原蛋白的分泌。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

【参考文献】