MicroRNA-486在原代心肌细胞低氧损伤中保护作用的初步研究

发布时间：2019-03-11 17:03

【摘要】：目的1.构建mo-microRNA-486过表达腺病毒(Ad-miR-486)及mo-miR-486-antago腺病毒(Ad-miR-486-antago)。2.培养乳鼠原代心肌细胞,构建心肌细胞低氧损伤模型以模拟急性缺血。3.应用Ad-miR-486及Ad-miR-486-antago转染原代心肌细胞,使得miR-486过表达及低表达,观察心肌细胞损伤及凋亡等生物学特性指标,以明确miR-486对心肌细胞缺血适应的调节作用,并为临床防治及减轻心肌缺血导致的损伤提供新的思路及实验依据。方法1.构建携带miR-486的腺病毒载体,利用HEK293细胞对病毒进行包装、扩增、纯化,从而获取大量携带miR-486的腺病毒,实时定量PCR鉴定扩增的腺病毒,以TCID50法(50%组织细胞感染量)测定腺病毒感染滴度。2.构建心肌细胞低氧损伤模型以模拟急性心肌缺血损伤过程。取出生1~3天的SD大鼠乳鼠,消毒后在无菌条件下分离纯化心室肌细胞置于(37℃,5%CO_2)培养箱中培养,72小时后换以无血清DMEM培养12小时后进行实验,分别于常氧培养箱(37℃,5%CO_2-95%Air)及低氧培养箱(37℃,1%O_2-94%N2-5%CO_2)培养,48小时后收集各组细胞及细胞上清液。以常氧培养作为对照,测定细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性反应细胞损伤程度,CCK-8法测定心肌细胞活性,pi染色检测细胞周期,应用流式细胞仪测定细胞凋亡程度,同时收获细胞提取总RNA,通过real-time PCR测定心肌细胞低氧培养下的miR-486的表达变化。3.miR-486过表达和低表达的干预实验。以构建的A的-miR-486及Ad-miR-486-antago转染原代心肌细胞模拟miR-486过表达和低表达过程,实验分组如下:(1)常氧培养组;(2)低氧培养组;(3)转染A的-miR-486常氧培养组;(4)转染Ad-miR-486-antago常氧培养组;(5)转染Ad-miR-486低氧培养组;(6)转染Ad-miR-486-antago低氧培养组。实验结束后收集细胞及上清液测定上述指标。结果1.利用HEK293细胞包装扩增的Ad-gfp,Ad-miR-486及Ad-miR-486-antago,纯化后Ad-gfp感染滴度为2×1011pfu/ml,Ad-miR-486和Ad-miR-486-antago感染滴度为1×10~（11）PFU/ml。2.心肌细胞低氧损伤模型的构建。与常氧培养的心肌细胞相比,低氧培养24小时后心肌细胞表面积减少、细胞间隙变大、培养液中悬浮的死细胞增多、细胞搏动节律明显变慢。3.原代心肌细胞在低氧条件下培养6h、12h、24h、36h、48h后,检测miR-486表达的变化,0~24h内miR-486表达明显上调,至24h达到最高,24h~48h内miR-486表达逐渐下调。4.低氧培养下,转染Ad-miR-486后较低氧空白对照组细胞ldh活性下降了64%,细胞活力上升了28%,细胞凋亡率下降了23%;转染Ad-miR-486-antago后较低氧空白对照组细胞LDH活性上升了30%,细胞活力下降了40%,细胞凋亡率上升了44%。结论原代心肌细胞在低氧培养下,miR-486的表达明显上调,至24h达到高峰,过表达的miR-486可以降低低氧条件下细胞凋亡率、提高细胞活力、减轻细胞损伤,而低表达的miR-486则增加了低氧条件下细胞凋亡率、降低了细胞活力、增加了细胞损伤。该实验结果表明,miR-486在心肌细胞缺氧状态下能够减轻细胞损伤、抑制凋亡,具有一定的心肌保护作用。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R541

【参考文献】