香烟提取物促进人肺动脉平滑肌细胞增殖及其机制

发布时间：2019-03-25 11:46

【摘要】：目的:肺动脉高压是一种复杂的小肺动脉疾病,以持续性血管收缩,血管壁的增厚,血管改建和进展性肺动脉阻力的增加为特征,其病情发展可导致右心衰竭并最终导致死亡。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的异常增殖被认为是血管壁增厚,血管改建,动脉管腔狭窄的主要原因。最近的动物和人的实验研究均表明,除了缺氧外,吸烟可能对血管结构的变化产生直接的作用,致使发生肺动脉的改建进而发展为肺动脉高压。然而,这其中准确的机制尚不完全清楚。细胞内钙离子在调节血管平滑肌中扮演着重要的作用。细胞内钙离子的增加可以激活收缩蛋白,并引起收缩反应。细胞内钙离子浓度的增加主要依赖肌浆网(SR),电压门控钙通道(voltage-operated calcium channels,VOCC),和钙库操作性钙通道(store-operated calcium channel,SOCC)。近年来,SOCC 在血管平滑肌领域获得了极大的研究注意。SOCC是一种高度选择性的钙通道,其组分构成尚不完全清楚,且因细胞种类不同而异,目前已发现包括基质相互作用分子(stromal interaction molecule,STIM)家族、Orai、一过性受体电位非选择性阳离子通道(transient receptor potential non-selective cation channel,TRPC)家族。TRPC 是SOCC的重要组成部分,可以被G蛋白偶联受体和酪氨酸激酶受体活化,是一种非选择性、Ca2+渗透性阳离子通道,有证明表明好几种TRPC通道充当SOCC的组成,然而,大部分证据都依赖于特定TRPC亚型的敲除或者siRNA的转染沉默,而非直接证明其在SOCC的功能。一个重要的研究发现是,特定亚型的TRPC的敲除可引起同等程度的SOCC活动和钙内流的抑制。一般来说,TRPC1,4和5对钙库的耗竭敏感,是SOCC的组成部分,TRPC3,6和7组成受体操作性钙通道(receptor-operated channels,ROCs),为 G 蛋白激酶 C 和甘油二酯提供门控。STIM家族主要包括两种亚型,STIM1和STIM2,有实验证明在HEK293细胞,STIM1被siRNA转染后的表达下调可抑制毒胡萝卜素引起的钙内流和毒蕈碱刺激诱导的钙电流,但是不改变剩余钙离子水平,膜电位。而STIM2的抑制则没有STIM1明显。STIM1氨基端的信号肽序列和跨膜部分表明蛋白的氨基端对应着细胞内基质和ER的管腔,所以STIM1可能充当钙离子感受器的作用,引起SOCE的活动。STIM1以介导非兴奋细胞的钙触发钙释放电流而作为其主要功能,同时,STIM1也被发现在内质网膜上充当感受器。在PASMC,SOCC主要由表达于内质网的钙离子感受器STIM1与表达于细胞膜的非选择性蛋白TRPC1是SOCC的重要组成部分。通过SOCC形成的操作性钙内流(store-operated calcium entry,SOCE),近年来获得了极大地研究关注。尽管SOCE被发现已有20年,但SOCC的构成和功能一直存在争议。SOCE是一种重要的细胞程序,与许多细胞活动相关,如增殖、迁移、收缩等。之前有许多研究证明,不同类型的细胞内SOCE的阻断可抑制细胞增殖,而细胞增殖则与SOCE的增强有关。SOCE形成的典型细胞内信号转导途径如下:当胞内尤其是肌质网储存的Ca2+的耗竭时,内质网上的跨膜蛋白即钙离子感受器STIM1聚集成簇并脱离内质网结合位点,朝细胞膜移动,将成孔蛋白TRPC1活化,并形成STIM1—TRPC1复合体,导致Ca2+通道开放,进而形成SOCE。SOCE在PASMCs的增殖和迁移中扮演重要角色,SOCE的阻滞剂如Ni2+、SKF96365能明显减缓PASMC的增殖。细胞周期蛋白D1(cyclin D1)是cyclin家族中的重要成员,是细胞增殖程序重要的调节物质,在细胞增殖过程,cyclin D1可作为丝分裂的感受器,同时也能通过驱动目的细胞度过G1期以促进细胞增殖。作为一种协作癌基因,cyclin D1基因在恶性肿瘤患者频繁过表达,并且在肿瘤的发展、维持中起着十分重要的作用。有模型表示cyclin D1的过表达在细胞周期调控途径中可能充当驱动癌基因的角色。肿瘤生长阶段,可较早发现cyclin D1表达过剩。且近来越来越多的报道指出,cyclin D1是与肺动脉高压相关的重要的下游媒介,可通过促进PASMCs增殖的方式参与肺动脉血管的重塑。基于以上证据,我们假设吸烟促进PASMCs增殖的机制为:吸烟诱导PASMC的SOCC表达的上调(SOCE的增强),接着SOCE的增强引起下游的cyclin D1表达增加来促进细胞增殖。本实验将就此假设研究吸烟引起细胞增殖的分子机制。方法:第一部分:研究CSE对HPASMCs增殖的影响。对HPASMCs分别进行0(对照组),0.5%,1%,2%,3%,5%,10%浓度的CSE处理,24小时后观察HPASMCs的增殖情况。第二部分:研究CSE处理后细胞的STIM1,TRPC1和cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平,以及钙离子浓度。根据第一部分的实验结果,将HPASMCs分成4组即0(对照组)、0.5%CSE组、11%CS组、33%CS组,并分别应应用western blot和RT-PCR检测各组细胞的STIM1,TRPC1和cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平,为更直观地观察各组细胞内钙离子浓度,使用钙探针对各组细胞内钙离子浓度进行检测。第三部分:研究SOCC与cyclin D1的关系。对HPASMCs进行siRNA(TRPC1)转染和阴性对照转染,再对两类HPASMCs各4组的细胞增殖情况和cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果:第一部分:0.5%,1%CSE组对HPASMCs有促进增殖作用(P0.05),且0.5%CSE组促进作用更加明显(P0.05),而3%及以上浓度的CSE对HPASMCs反而有抑制作用(P0.05)。第二部分:与对照组相比,0.5%,1%CSE组的STIM1,TRPC1,cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平,以及细胞内钙离子浓度都有升高(P0.05)。而3%CSE组的STIM1,TRPC1,cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平和细胞内钙离子浓度则出现下降(P0.05)。第三部分:siRNA(TRPC1)转染组的HPASMCs增殖和cyclinD1 mRNA和蛋白表达水平均较阴性对照组降低(P0.05)。结论:第一部分:低浓度的CSE可以促进HPASMCs增殖,而高浓度的CSE则抑制HPASMCs 增殖。第二部分:CSE通过SOCE的增强(SOCC的上调)以促进HPASMCs增殖。第三部分:CSE通过(至少是部分)SOCC的介导的cyclin D1表达通路诱导HPASMCs 增殖。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R544.1

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