地塞米松下调DOT1L的分子机制及其在杀伤淋巴瘤和白血病细胞中的作用

发布时间：2019-04-15 19:53

【摘要】：研究背景:地塞米松(Dexamethasone,Dex)是一种典型的人工合成糖皮质激素,通过与糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptors,GR)结合发挥作用,作为临床上常用的处方药物之一,被广泛应用于白血病/淋巴瘤的治疗,但其作用机制至今尚未完全明了。DOT1L(disruptor of telomere silencing 1 like)是至今为止唯一可催化组蛋白H3第79位赖氨酸(H3K79)发生甲基化的一类特殊的组蛋白甲基转移酶。除参与染色质沉默、基因表达调控、细胞衰老和DNA损伤修复等生物学过程外,近年来也被陆续证实参与了多种肿瘤细胞的发生发展,如肺癌,乳腺癌,卵巢癌,肾透明细胞癌,神经母细胞瘤等,其中尤其是与MLL基因重排型白血病(MLL-rearranged leukemias)的关系受到国内外许多学者的持续追踪研究。DOT1L通过与MLL融合蛋白相互作用,异常修饰H3K79高甲基化,致促白血病发生发展的基因(MEIS1、Hoxa9等)持续活化,从而促进MLL重排型白血病的发生发展。因此DOT1L被认为是该型白血病新的治疗靶点,其特异性小分子抑制剂也正处于临床Ⅰ期试验阶段。然而DOT1L是否参与促进B淋巴瘤的发生发展以及DOT1L能否受Dex调控,至今仍未报道。研究目的:研究Dex对DOT1L的表达调控及其分子机制在其抑制B淋巴瘤和MLL基因重排型白血病细胞增殖中的作用。研究方法:(1)分别提取B淋巴瘤细胞(Raji、Namalwa、Daudi、Jeko-1)、人急性单核细胞白血病细胞THP-1和MLL重排型白血病细胞MV4-11的组蛋白,通过Western blot检测DOT1L/H3K79的基础蛋白水平;用TCGA数据库分析DOT1L在血液系统肿瘤与正常组织中的差异表达情况。(2)用GR激动剂Dex分别处理B淋巴瘤细胞Raji、人急性单核细胞白血病细胞THP-1和MLL基因重排型白血病细胞MV4-11,首先提取m RNA、逆转录为c DNA、通过Real-time PCR从转录水平检测DOT1L及其靶基因MEIS1的表达情况;然后提取细胞组蛋白,通过Western blot从翻译水平检测DOT1L效应蛋白H3K79甲基化水平;CCK-8法检测增殖情况。(3)以GR拮抗剂RU486米非司酮(Mifepristone,Mfp)预处理上述细胞,再与Dex共孵育,通过Real-time PCR、Western blot分别从转录水平和翻译水平检测DOT1L、MEIS1表达情况;CCK-8法检测增殖情况。(4)合成特异性针对DOT1L的siRNA,转染入Raji细胞,CCK-8法检测Raji增殖情况。(5)在核受体网站上预测DOT1L的启动子区含有GR的结合位点,构建含GR结合位点的DOT1L上游启动子区(-1800~+200bp)重组质粒,用双荧光素酶报告基因检测系统检测GR激动剂Dex及GR拮抗剂RU486对该区段DOT1L启动子活性的影响。(6)用放线菌素Act D(Actinomycin D)预处理,再与Dex共孵育,通过Real-time PCR从转录后水平检测DOT1L表达情况。研究结果:(1)DOT1L在血液系统肿瘤组织中表达水平明显高于正常组织;细胞水平上,相比于高表达DOT1L的MV4-11细胞,DOT1L在各B淋巴瘤细胞系中表达水平相对较高,而DOT1L在人急性单核细胞白血病细胞THP-1中表达水平较低。(2)Dex抑制Raji细胞和MV4-11细胞增殖;并能下调Raji细胞中DOT1L及其靶基因MEIS1的m RNA水平和DOT1L效应蛋白H3K79甲基化水平;对于MV4-11细胞,Dex仅能下调DOT1L效应蛋白H3K79甲基化水平,其mRNA水平不受影响。其中,THP-1细胞的增殖水平以及DOT1L表达水平不受Dex影响,是本实验体系中的阴性对照。(3)上述实验现象均能被米非司酮RU486所阻断,说明Dex对DOT1L的下调作用是通过活化GR来完成。(4)干扰DOT1L能明显抑制B淋巴瘤细胞Raji的增殖。(5)双荧光素酶报告基因实验证明Dex不是通过影响-1800bp~+200bp区段DOT1L启动子活性来下调其表达,说明存在其他调节机制。(6)Dex通过在转录后水平抑制DOT1L mRNA稳定性来下调B淋巴瘤细胞Raji中DOT1L表达。研究结论:(1)DOT1L在B淋巴瘤细胞系中表达水平相对较高。(2)研究首次发现Dex通过活化GR下调DOT1L基因的表达至少是其杀伤B淋巴瘤细胞和MLL基因重排型白血病细胞的部分机制。(3)在B淋巴瘤细胞Raji中,Dex通过抑制DOT1L稳定性来下调DOT1L表达,而非影响其启动子区转录活性。(4)研究首次发现DOT1L具有促进B淋巴瘤细胞增殖的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R733

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本文编号：2458445