MicroRNA-149在左心疾病相关肺高压形成中的作用及预测价值

发布时间：2019-06-18 09:49

【摘要】：研究背景:肺高压(pulmonary hypertension,PH)是引起右心衰竭和猝死的主要原因,根据病因和发病特点不同,国际上将肺高压分为五大类,其中的第二大类——左心疾病相关肺高压(pulmonary hypertension due to left heart diseases,PH-LHD)在临床上发病率最高、最常见[1]。引起PH-LHD最常见的左心疾病(left heart diseases,PLHD)包括心力衰竭和心脏瓣膜病。LHD导致左心负荷增高时,压力逆向传递引起的肺静脉压力升高,是导致肺血管重构和PH的常见初始原因,但也有研究表明PH形成后,即使解除引起压力升高的因素,肺血管重构和PH仍然会继续进展[2],提示LHD导致PH时,可能还存在其他机制。PH是引起LHD患者症状加重的原因,与预后不良密切相关。但临床上,PH-LHD难以做到早期发现和诊断,因为PH-LHD常见表现,包括气短、乏力、活动耐量降低等,并不特异,往往和LHD引起的症状难以鉴别。PH是一个血流动力学概念,右心导管(right Heart Catheter,RHC)检查是诊断PH-LHD的金标准,但目前RHC并不是LHD患者的一个常规检查[1],同时RHC具有有创性,限制了其临床应用及LHD患者PH的诊断。超声心动图依然是临床上诊断PH-LHD重要的手段,超声心动图虽然在明确病因和判断右心功能损害方面有不可替代的优越性,但在估测肺动脉压方面尚有不足[3]。因此寻找新的更灵敏特异的检查手段有重要的临床意义。同时,目前临床上尚没有针对PH-LHD的有效治疗方法,前列环素类和吸入性NO等药物虽能暂时降低肺动脉压力,却不能逆转PH-LHD的进展,也不能改善疾病的长期预后[4,5]。因此,进一步探索PH-LHD发生发展的机制,对其早期发现和治疗均有重要作用。生物标志物是PH诊断研究中的重点,如脑钠肽、IL-6、胆红素和尿酸等,与PH患者的预后相关,但对PH的早期诊断缺乏很好的特异性[6,7]。目前研究最多的是脑钠肽和脑钠肽前体,但因容易受到患者肾功能的影响,降低了其特异性[8]。稳定存在于体液中的循环微小RNA(Micro RNA),已成为新的研究热点,循环Micro RNA的分布在不同病理状态下会发生特定的变化,可作为检测癌症、心血管疾病和糖尿病等重大疾病早期的新型生物标志物[9,10],但与PH-LHD相关的循环micro RNA的分析及作用鲜有报道。因此筛选PH-LHD早期血清中表达变化的micro RNA,为寻找特异生物标志物提供线索。作为进化上保守的内源性非编码RNA,Micro RNA在转录后水平起着调控靶基因的作用[11]。循环Micro RNA不仅可以作为疾病相关的生物标志物,还可在细胞之间传递信号,参与PH的发生发展。如mi R-143,通过参与肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)和肺动脉内皮细胞(PAEC)的交流,在缺氧诱发的PH发生发展中起着重要作用[12]。特定的micro RNA在肺血管壁细胞功能改变中也有着重要作用,如mi R-21,mi R-27a,mi R-17-92簇,mi R-124簇等,通过引起PAEC功能不全,调控PASMC的增殖和迁移等途径,导致血管重构,参与了PH发展[13]。而PH-LHD的发生发展中的micro RNA研究较少。作为一种敏感的高通量检查方法,micro RNA芯片能快速筛查出不同样本间所有已知的micro RNA表达变化[14]。生物信息学常用于对筛查的micro RNA进行深入分析,能对疾病发生相关的基因进行数据分析、功能注释及通路分析,加深对疾病发生机制的认识[14]。左心超负荷动物模型能模拟PH-LHD的病理生理进程,是常用的PH-LHD模型[15]。通过芯片筛查模型肺组织中差异表达的micro RNA,可预测与PH-LHD相关的靶基因位点。进一步生物信息学分析,得出PH-LHD相关的micro RNA及关键信号通路,从而为PH-LHD的诊断和治疗提供理论依据。研究目的:通过建立大鼠主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)模型,观察左心负荷增高对肺血流动力学及肺血管重构的影响;利用芯片筛选出TAC大鼠模型肺组织表达变化的micro RNA谱,分析其调控的靶基因与信号通路,并在组织和循环水平上进行验证,分析循环micro RNA变化与血流动力学的相关性;通过临床病例验证,进一步探索micro RNA对PH-LHD的预测意义。实验方法:第一部分:1.建模:40只健康雄性SD大鼠随机分为Sham组(n=20)和TAC组(n=20),TAC组在主动脉弓处以16G针头垫扎,形成主动脉弓缩窄;Sham组不结扎主动脉弓。2.检测指标:1)一般情况;2)心脏超声检测大鼠心脏重构和功能;3)心导管检查明确血流动力学变化;4)病理学观察肺血管重构。第二部分:1.利用micro RNA芯片检测TAC和Sham大鼠肺组织样本,筛选micro RNA的差异表达谱,并使用mi R-Path v.3预测经过聚类的两组差异micro RNA靶基因,得到靶基因的富集结果,预测PH-LHD相关信号通路。2.采用基于SYBR Green荧光染料的方法对肺组织差异表达的micro RNA行实时定量PCR检测验证;进一步检测大鼠血清micro RNA水平,并统计分析其与大鼠血流动力学指标的相关性。第三部分:1.根据纳入排除标准选取于2014年6月至2016年11月在第三军医大学第二附属医院心内科就诊患者,以PASP≥50mm Hg作为诊断PH的依据,收集PH-LHD患者34例、单纯LHD 46例。采集受试者的基本资料与临床数据:年龄、性别、身高、体重、吸烟史、体重指数、血压、心率、纽约心功能分级、心脏超声检测数据、BNP。采用实时定量PCR检测所有受试者血清中micro RNA水平,分析其与临床数据的相关性。2.使用SPSS软件(版本20.0,IBM公司,美国)进行统计分析。计量资料用中位数和四分位数间距表示,计数资料用例数和百分比表示;组间资料的差异采用Mann-Whitney U非参数检验进行分析;采用Spearman相关系数评估mi R-149水平与临床指标的相关性;采用logistic回归进行单因素、多因素分析,并计算得到比值比、95%可信区间;采用ROC曲线进行预测价值分析,并计算到曲线下面积、敏感度、特异度。结果:第一部分:1.手术过程中因麻醉意外、气胸、主动脉破裂原因导致TAC组3只死亡,Sham组9只死亡;在8周的饲养过程中,观察到与Sham组相比,TAC组模型体重减轻,四肢及胸前区出现青紫,精神状态欠佳,共计7只在饲养过程中死亡;最后得到10只TAC模型,11只Sham模型。进一步称重测量表明,与Sham组相比,TAC组右心肥厚指数(RVHI)升高(23.46±0.77%vs27.40±2.68%;P=0.010)。2.模型建立8周时,心脏超声检查提示,与Sham组(n=11)相比,TAC组(n=10)肺动脉直径增大:2.61(2.50,3.31)mm vs 2.97(2.75,3.25)mm(P0.05);左室射血分数降低:84.99(79.53,88.46)%vs 69.75(56.57,82.61)%(P0.05);左室心肌质量增加:573.27(465.68,677.54)mg vs 680.77(588.27,836.55)mg(P0.05);舒张期左室体积增大:160.40(125.04,187.51)ul vs 201.86(162.47,217.21)ul(P0.05)。3.模型建立8周时,右心导管检查发现,与Sham组(n=11)相比,TAC组(n=10)mean pulmonary arterial pressure(m PAP)升高(16.22±2.23mm Hg vs 22.13±2.74mm Hg;P0.001),其中90%的模型大鼠m PAP介于19-24mm Hg之间,属于临界PH;1只模型大鼠m PAP达到28.64mm Hg,形成PH。同时LVSP(140.04±28.01mm Hg vs172.22±29.17mm Hg;P0.001)、RVSP(26.66±2.74mm Hg vs 29.12±2.08mm Hg;P=0.031)升高,LV Max(dp/dt)(12278.66±1309.28mm Hg/s vs 9124.76±838.36 mm Hg/s;P0.001)、RV Max(dp/dt)(1892.47±272.69 mm Hg/s vs 1491.78±261.20 mm Hg/s;P=0.003)降低。4.模型建立8周时,肺动脉及肺组织行HE染色,观察到Sham组肺小动脉管壁较薄,管腔通畅,未见狭窄,TAC组肺小动脉管壁明显增厚,部分肺小动脉出现管腔闭塞,周围出现细胞聚集炎症改变。与Sham组比较,TAC组肺动脉中膜厚度百分比增加(27.41±2.38%vs 54.95±4.81%;P=0.027)。进一步行免疫荧光染色观察到TAC组肺小血管管壁增厚,管腔变窄。第二部分:1.以Sham组大鼠肺组织为对照,经micro RNA芯片分析,一共对385个micro RNA进行检测分析,筛选出TAC组水平差异大于1.5倍且具有统计学意义的micro RNA,差异基因经过聚类分析排除个体差异,发现较Sham组,TAC组上调的有rno-mi R-143-3p、rno-mi R-181a-5p、rno-mi R-125b-1-3p,下调的有rno-mi R-206-3p、rno-let-7b-5p、rno-mi R-200b-3p、rno-mi R-21-5p、rno-let-7b-5p、rno-mi R-149-3p,进一步KEGG信号通路分析发现差异变化的micro RNA靶基因(其中包括Tnf、Chrd、Smad2、Smad7、Acvr1c、Acvr2a、Rps6kb1、Smurf2、Bmp5、Tgfbr1)的功能集中于TGF-β信号通路。2.进一步验证大鼠肺组织mi R-149水平,发现TAC组mi R-149水平下调,RQ值分别为(1.141±0.201vs 0.300±0.028;P0.001)。检测TAC大鼠血清mi R-149水平,发现变化趋势与肺组织一致,相对定量(RQ)值分别为(1.018±0.060vs 0.467±0.047;P0.001);统计分析循环mi R-149水平与大鼠血流动力学指标相关性分析,循环mi R-149水平与m PAP(r=-0.752,P0.001)、RVHI(r=-0.643,P=0.002)呈负相关,与LVSP(r=0.739,P0.001)、RV Max(dp/dt)(r=0.534,P=0.013)、LV Max(dp/dt)(r=0.728,P0.001)呈正相关,与RVSP(r=-0.309,P=0.173)统计学上无相关性。第三部分:1.检测受试者循环mi R-149水平,发现LHD对照组以及PH-LHD组RQ值分别为1.00(0.73,1.81)vs 0.58(0.49,1.08),经统计学析PH-LHD组mi R-149的表达显著低于LHD组(P=0.002)。采用Spearman相关性分析发现受试者循环mi R-149与PASP(r=-0.286,P=0.010)、左心室舒张末期内径(r=-0.345,P=0.002)、BNP(r=-0.306,P=0.006)、纽约心功能分级(r=-0.232,P=0.038)呈负相关;与LVEF呈正相关(r=0.247,P=0.027)。2.通过logistic回归分析发现,循环mi R-149降低,PASP≥50mm Hg发生的可能性增高。应用ROC曲线评估mi R-149对PASP≥50mm Hg发生的预测价值:AUC=0.699,95%CI:0.579~0.820(P=0.002),其最佳阈值为0.52,敏感度为0.500,特异度为0.891。采用二元Logistic正向逐步回归筛选出预测PASP≥50mm Hg的联合标志物为左心房舒张末期内径、循环mi R-149和BNP并获得其预测模型,ROC分析表明预测模型曲线下面积(AUC)为0.889(95%CI:0.818~0.960,P0.001),阈值为0.41时敏感度为0.882,特异度为0.818,较单独循环mi R-149预测价值高。结论:1.主动脉弓缩窄导致左心负荷增高和左心功能降低的同时,引起肺动脉压轻度增高和右心功能损害。2.主动脉弓缩窄导致左心负荷增高和左心功能降低时,肺组织micro RNA表达谱发生变化,其中rno-mi R-143-3p、rno-mi R-181a-5p、rno-mi R-125b-1-3p上调,rno-mi R-206-3p、rno-let-7b-5p、rno-mi R-200b-3p、rno-mi R-21-5p、rno-let-7b-5p、rno-mi R-149-3p下调,KEGG信号通路分析发现芯片筛选的差异变化micro RNA靶基因的功能集中于TGF-β信号通路。3.动物模型中TAC组大鼠肺组织和循环mi R-149水平较Sham组显著降低。4.与LHD患者相比,PH-LHD患者循环mi R-149水平显著降低,循环mi R-149可作为LHD患者合并PH的独立预测因子。联合mi R-149、左心房舒张末期内径和BNP预测LHD患者合并PH的敏感性为0.882,特异性为0.818。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R544.1

【参考文献】