Sirt1对缺血再灌注损伤心肌的保护作用及信号通路机制研究

发布时间：2019-07-11 15:49

【摘要】：研究背景随着社会环境和饮食结构的变化,发病率和死亡率在心血管系统疾病中出现逐年上升趋势,而且发病年龄越来越年轻,特别是冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)、急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)和心力衰竭(Cardiac Failure,CHF)等是心血管疾病发病率和死亡率增加的主要原因,也是心脏源性猝死的主要病因之一[1]。在发达国家死亡原因最常见的是冠心病[2]。WHO全球统计数据显示由冠心病和循环系统疾病导致的死亡从1999年至2010年已经上升了1/3,而在2015年每死亡3个人中就有一个是由于冠心病[3],因此预防和治疗冠心病成为人类迫切解决的问题。Sirt1近似同种类的酵母沉默信息调节因子2(Silent Information Regulator-2,Sir2),是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD)脱乙酰蛋白酶。Sirtuins有7个家族成员即Sirt1~Sirt7,但是Sirt1一直是被广泛研究的sirtuin蛋白[4]。Sirt1在大脑、心脏、肝脏、胰腺、骨骼肌、脾脏和脂肪组织等身体器官中表达,它存在于细胞核和细胞质中但主要是在细胞核中表达[2]。Sirt1调节的脱乙酰化作用对于许多蛋白质的活性具有重要的作用,调节蛋白质的转录和翻译,蛋白质的翻译在许多生物功能中具有重要的功能,如氧化应激、新陈代谢、细胞增殖和基因组的稳定性[5]。此外,Sirt1一直与老化、代谢疾病、神经退化性疾病、癌症和心血管疾病有关[6]。磷脂酰肌醇-苏氨酸蛋白激酶(Phosphatidyl Inositol 3-kinase/Serine-threomine kinase,PI3k-Akt)信号通路不仅在癌症中具有重要的作用,而且在正常细胞中也具有重要的作用。这条通路在细胞的许多生物学功能中具有重要的作用,如增殖、粘附、迁移、侵入、代谢和存活等[7]。基于上述情况,根据目前国内外有关的研究进展我们提出以下问题:白藜芦醇能否促进Sirt1的表达,并在缺血灌注损伤中保护心肌细胞?Sirt1是否通过上调PI3k-Akt信号通路起到保护心肌细胞的作用呢?研究目标1.观测在缺血再灌注损伤过程中Sirt1是否对心肌细胞有保护作用。2.探讨Sirt1对PI3k-Akt信号通路的影响,明确Sirt1心脏保护作用的发生机制。研究方法1.心肌细胞系(H9c2)随机分为对照组(Control组)和缺氧复氧组(H/R),其中缺氧复氧组分为3组,一组给予含25μM白藜芦醇培养基培养,一组给予含1μM EX527和25μM白藜芦醇培养基,最后一组给予正常培养基,培养2 d-3 d后进行缺氧复氧干预,对照组不做任何处理。2.应用TUNEL免疫荧光染色法,在荧光显微镜下观察各组H9c2心肌细胞系细胞凋亡情况并计算凋亡率。3.应用DHE免疫荧光染色法在荧光显微镜下观察各组心肌细胞的活性氧水平,并计算活性氧比率。4.应用MTT比色法,检测各组心肌细胞的细胞活性。5.采用JC-1免疫荧光染色法,检测各组心肌细胞中线粒体的膜电位,并计算红光与绿光的比值。6.应用抗体免疫荧光检测Sirt1在心肌细胞核中的表达情况。7.采用Western Blotting免疫印迹法检测各组心肌细胞中Sirt1和p-Akt表达情况。8.采用Western Blotting免疫印迹法检测加入Akt特异性抑制剂LY294002后,心肌细胞中Sirt1和p-Akt蛋白的表达水平。研究结果1.与对照组(0.240±0.007)相比,缺氧复氧组(0.487±0.013)凋亡率显著上升(P0.001);与缺氧复氧组(0.487±0.013)相比,加入Sirt1激动剂白藜芦醇预处理组(0.255±0.010)凋亡率显著降低(P0.001),而Sirt1抑制剂组(0.569±0.010)凋亡率最高(P0.001)。2.与对照组(0.222±0.004)相比,缺氧复氧组(0.372±0.020)细胞活性氧水平显著上升(P0.001),与缺氧复氧组(0.372±0.020)相比,白藜芦醇预处理组(0.256±0.026)活性氧水平显著降低(P0.001),而EX527组(0.593±0.018)细胞活性氧显著上升(P0.001)。3.与对照组(0.778±0.007)相比,缺氧复氧组(0.455±0.002)细胞活性显著降低(P0.001)缺氧复氧组(0.455±0.002)相比,白藜芦醇组(0.587±0.005)细胞活性水平显著上升(P0.001),EX527组(0.240±0.009)细胞活性水平最低(P0.001)。4.与对照组(3.822±0.007)相比,缺氧复氧组(2.579±0.006)线粒体膜电位水平显著降低(P0.001),与缺氧复氧组(2.579±0.006)相比,白藜芦醇组(3.904±0.042)线粒体膜电位显著上升(P0.001),而EX527组(1.517±0.037)线粒体膜单位水平最低(P0.001)。5.与对照组(0.333±0.026)相比,白藜芦醇组(0.574±0.018)中Sirt1在细胞核的表达也显著增加(P0.001)。6.对照组中Sirt和p-Akt相对灰度值分别为(1.697±0.020)和(0.0137±0.0005);缺氧复氧组分别为(2.141±0.015)和(0.0156±0.0004);与对照组相比,缺氧复氧组中Sirt1的表达水平显著降低(P0.001),而p-Akt蛋白的表达无显著性差异。白藜芦醇组相对灰度值为(3.434±0.010)和(0.0227±0.0009),与缺氧复氧组(2.141±0.015)和(0.0156±0.0004)相比,Sirt1和p-Akt蛋白表达显著上升(P0.001);EX527组蛋白灰度值为(1.530±0.030)和(0.0120±0.0004),与缺氧复氧组相比Sirt1和p-Akt蛋白的表达水平显著降低(P0.001)。7.LY294002可以抑制Akt蛋白的表达水平,对照组中p-Akt蛋白的相对灰度值为(2.353±0.059),加入LY294002后p-Akt蛋白的相对灰度值为(1.548±0.021),两组相比具有显著的差异(P0.001)。加入LY294002后Sirt1蛋白的表达也显著降低,对照组中Sirt1蛋白的相对灰度值为(2.355±0.262),而加入LY294002后Sirt1蛋白的相对灰度值为(1.214±0.151),两组相比具有高度显著差异(P0.001)。研究结论1.缺氧复氧能成功模拟心肌梗死缺血再灌注损伤心肌细胞系H9c2细胞凋亡率显著上升。2.Sirt1能够减轻H9c2细胞在缺血再灌注中的损伤,其中PI3k-Akt信号通路在Sirt1减轻H9c2缺血再灌注损伤中发挥重要作用。3.该研究为预防和治疗CHD提供新的靶点及重要的理论基础。
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图片说明： -18-图 1：Sirt1 在肝脏、肌肉、心脏和脂肪中的功能 ( Kahlilia C Morris,,et al. 2011,）2.2 Sirt1 与肝脏组织众所周知，体内葡萄糖稳态的最关键调节来自于肝脏，当血液中葡萄糖因为禁食等处于低水平状态时，肝脏代谢会迅速转变为葡萄糖分解，发生糖异生从而保障葡萄糖的供应，体内产生的酮体也会发生相应的反应补充葡萄糖的缺乏。禁食会激活肝脏中的脂肪组织（WhiteAdipose Tissue ，WAT）发生脂肪酸氧化，一些转录因子参与这些复杂的转化从而使机体适应能量缺乏，禁食时 Sirt1 调节代谢转化[84]，在初始阶段（葡萄糖未分解阶段）胰岛 细胞产生胰高血糖素通过 cAMP反应结合蛋白（cAMP Response Element Binding Protein ，CREB）与它的共激活剂
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图片说明： 第四军医大学硕士学位论文再灌注损伤[118]。同样，，患有镰状细胞贫血的病人也遭受了很有特色的血管闭塞和后续再灌注的痛苦，这种反应类似于缺血再灌注[119]。要指出的是缺血性症状是在缺血条件下多种器官症状的组合，尽管这些症状有着相似的生物应答反应，但是不同系统灌注减少相对于缺血再灌注器官损伤的单一区域相比其影响也具有很大的差别[117]。事实上多种病理过程参与组织的缺血再灌注损伤（图 2），比如出现在缺血过程中低氧导致腺苷酸环化酶活性和细胞内 cAMP 水平降低伴随着血管通透性增加，使得内皮细胞的屏障功能受损。此外，缺血再灌注激活了包括凋亡和与自噬有关的细胞死亡及坏死[120]。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54


本文编号：2513275