诱导型心肌特异性丙酮酸脱氢酶敲除对心肌缺血损伤的影响及其机制

发布时间：2019-08-11 12:08

【摘要】：缺血性心肌病(IHD)是指由于冠状动脉狭窄闭塞,以及心肌慢性缺血引起的心肌供血、供氧障碍,导致心肌收缩舒张功能受损以及心肌梗死。由于心肌的高耗能特性,IHD也可称为“代谢疾病”。在心肌梗死过程中,心脏需要快速适应缺氧/缺血状态,经历从有氧代谢到无氧代谢的巨大转变。缺血状态下心肌能量代谢的适应性改变对缺血心肌的能量维持和抗缺血能力至关重要。因此,阐明心肌缺血过程中调控能量代谢的关键因子并探寻相应的IHD防治策略是亟待解决的重要问题。丙酮酸脱氢酶复合体(Pyruvate dehydrogenase complex,PDHc)是线粒体基质内的多酶复合物,由三种酶(E1:丙酮酸脱氢酶,E2:二氢硫辛酰转乙酰基酶,E3:二氢硫辛酸脱氢酶)组成。该酶复合物是催化丙酮酸氧化脱羧成乙酰辅酶A的关键酶。PDHc所催化的反应过程连接了糖酵解,柠檬酸循环以及ATP形成。已有证据显示,心肌PDHc活性对于不同病理条件下心肌能量应答发挥重要作用。但是,正因为PDH对细胞能量代谢的重要作用,单纯敲除PDH造成动物致死性,以往对心肌PDH的生物学作用研究缺乏良好的动物模型。此外,在心肌缺血状态下,PDH多酶复合物中三种酶的心肌特异性作用和相关信号转导机制也缺乏深入的探讨。AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是细胞内最重要的应激反应调节酶之一,其激活和失活主要受细胞内能量水平调节。当细胞内能量需求增加或供应减少而导致AMP与ATP比例失调时,AMPK激活可使ATP合成系统活性增强同时使ATP消耗减少。我们前期工作证实,缺血心肌中AMPK激活可调控心肌的能量底物代谢,通过影响葡萄糖转运介质GLUT4的膜转位增加缺血心肌对葡萄糖的利用。并且,我们前期工作还发现,缺血心肌AMPK的磷酸化激活依赖于其上游激酶LKB1与Sestrin2蛋白形成激活复合物。同为重要的能量代谢调控因子,PDH对心肌AMPK是否存在调控作用?在心肌缺血状态下PDH与AMPK的激活存在何种相互作用?都尚待阐明。因此,本研究构建了诱导型心肌特异性PDH E1α敲除小鼠(inducible cardiac-specific PDH E1αknockout,PDH E1αi CKO),探讨了心肌特异性PDH E1α缺失对心肌缺血损伤的影响,并分析相关信号机制。目的:(1)明确PDH活性对心肌缺血损伤的影响;(2)明确心肌缺血状态下,PDH对心肌葡萄糖代谢的调节作用,(3)探讨PDH上述生物学作用是否与AMPK有关并分析PDH与AMPK相互作用的分子机制。方法:构建PDH E1αi CKO小鼠,以Cre小鼠为对照,建立在体心肌缺血模型,分别于缺血后不同时间点收集心肌组织检测相关信号表达,心脏收缩舒张功能和形态学观察。采用Working-Heart灌流系统检测心肌葡萄糖及脂肪酸代谢,糖酵解及葡萄糖摄取。结果:(1)通过他莫昔芬可诱导的心肌特异α-MHC启动子驱动的Cre转基因小鼠(α-MHC-Cre ERT2)作为介导敲除的工具鼠,将其与PDH E1α条件基因小鼠(PDH E1αflox/flox)结合获得α-MHC-Cre ERT2阳性的Flox/Flox鼠III(Cre ERT2-PDH flox/flox),采用PCR方法鉴定小鼠的基因型。Cre ERT2-PDHflox/flox小鼠注射他莫昔芬(0.08 mg/g,i.p.5 days)在体诱导心肌PDH E1α基因敲除。经PCR鉴定为阳性;提取各器官组织经Western-Blot检测证实成功构建在体可诱导心肌特异性PDH E1α敲除小鼠(PDH E1αi CKO)。(2)与单纯Cre ERT2对照小鼠相比,PDH E1αi CKO小鼠随年龄增加逐步出现心肌肥大表型。至4月龄,PDH E1αi CKO小鼠心重/体重比显著增加;TRITC-麦胚凝集素染色证实PDH E1αi CKO小鼠心肌细胞显著肥大;Mac-2免疫组化染色,Masson染色以及检测金属蛋白酶-9(MMP-9)和白细胞介素-6(IL-6)m RNA结果提示,PDH E1αi CKO小鼠心肌存在炎症细胞浸润及心肌纤维化。并且,与Cre ERT2对照小鼠相比,PDH E1αi CKO小鼠死亡率增加,生存周期显著缩短。(3)与心肌纤维化结果相一致,采用心脏超声检查证实:PDH E1α敲除导致心脏收缩舒张功能减退,左室舒张期间内径(LVID d)和射血分数(EF%),较Cre ERT2对照小鼠显著降低。并且发现,PDH E1α敲除显著降低了小鼠心肌基础代谢中葡萄糖氧化率。上述结果证实PDH在维持心肌功能和代谢中的重要作用。(4)为明确心肌特异性PDH E1α敲除的生物学后果,对PDH E1αi CKO小鼠及对照小鼠建立在体心肌缺血模型。结果显示,PDH E1α敲除显著加重心肌缺血损伤程度,心肌梗死面积显著增大。采用PDH特异性激动剂二氯乙酸(DCA)可有效增加对照小鼠心肌PDH活性,有效减轻心肌缺血损伤程度。上述DCA的心肌保护作用在PDH E1αi CKO被完全阻断。(5)进一步证实,采用DCA激活心肌PDH,可有效增加心肌缺血过程中葡萄糖转运蛋白(GLUT4)的膜转位,促进缺血心肌的葡萄糖摄取。并且发现,DCA激活心肌PDH可有效优化缺血心肌的能量底物代谢,增加对葡萄糖的利用而抑制脂肪酸氧化。(6)更为重要的是,我们的结果显示,采用PDH特异性激动剂DCA处理可有效增强缺血心肌的AMPK磷酸化水平。反之,DCA对缺血心肌损伤及能量代谢的调控作用在AMPK KD小鼠均被抑制。该结果提示,心肌PDH的生物学作用可能由AMPK活性所介导。(7)通过Co-IP结果首次发现,心肌PDH与AMPK存在直接调控关系。我们首次通过整体动物实验发现,心肌特异性PDH E1α敲除后,残余的PDH E2/3亚基复合物与心肌Sestrin2的相互作用显著增强,转而削弱了Sestrin2-LKB1复合物的形成,导致PDH E1αi CKO小鼠心肌在缺血过程中AMPK活性被抑制。结论:本研究首次采用诱导型心肌特异性PDH E1α敲除小鼠证实PDH是维持心肌心肌能量代谢以及收缩舒张功能的关键因子,激活PDH可以有效调整缺血心肌的底物代谢。我们首次发现,心肌PDH与AMPK存在直接调控关系,PDH缺失可导致AMPK失活并显著加重心肌缺血损伤。
【图文】：

复合物,丙酮酸脱氢酶,产物抑制,第一

图 1.1 PDH 复合体活性调控机制（引自 Sun W et al. Life Sci 2015）丙酮酸脱氢酶复合体会受到三种方式调控：第一种称为产物抑制，也就是复合物所催化生成的产物乙酰辅酶 A 与 NADH，能够抑制复合物的作

蛋白结构

及GLUT4膜转运。有趣的是，我们前期的初步数据还表明，AMPK促LUT4膜转位的机制是由于TUG的解离所引起。心肌缺血所致的AMPK，可以促使TUG裂解（由60KDa裂解为42KDa）。缺血心肌中的上述变化及TUG的裂解现象，在AMPK KD小鼠中均消失。因此，，我们的前期初步证实，缺血心肌AMPK活化刺激TUG裂解，并导致在细胞内囊UG和GLUT4之间的解离。TUG通过AMPK信号传导途径，是调节心LUT4至细胞表面，并增强葡萄糖摄取的关键环节。除了刺激GLUT4转运MPK也增强转录因子肌细胞增强因子-2（MEF-2），以与启动子结合以加GLUT4基因表达[146]。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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