动脉粥样硬化患者外周血可溶性环氧化物水解酶水平及其对胆固醇代谢的研究

发布时间：2019-08-11 11:26

【摘要】：第一部分动脉粥样硬化患者外周血可溶性环氧化物水解酶表达水平研究背景近年来,我国医疗水平虽然取得巨大进步,但动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)和其相关并发症仍然是威胁人类健康的主要原因之一。由于高脂饮食引起的动脉粥样硬化十分常见。动脉粥样硬化是一种炎症性疾病,系统性和/或局部的炎症参与了从动脉粥样硬化起始到斑块破裂的全过程。致动脉粥样硬化的众多因素例如氧化应激、晚期糖基化终产物、高血压和吸烟等都可导致血管细胞自噬,从而加速脂质的血管沉积、单核细胞向受损内皮迁徙黏附并进入内膜下转化为巨噬细胞。巨噬细胞还可分泌多种蛋白降解酶类如胶原酶和细胞外基质金属蛋白酶等,降解纤维帽中胶原成分,导致斑块不稳定甚至破裂,最终产生严重的临床后果如心肌梗死和脑梗塞等。在人体多种蛋白降解酶中,环氧化物水解酶可能在调控粥样硬化斑块中发挥作用。环氧化物水解酶广泛分布于动物界(包括人类),在肝脏中,环氧化物水解酶主要分布在内质网上,最近的研究表明,它也分布于肝细胞的核膜、胞浆中,而在环氧化物酶体、溶酶体和线粒体中缺失。环氧化物水解酶以多种同工酶形式存在,酶的单体相对分子量为48k-54k之间,没有血红蛋白和黄素做辅基。环氧化物水解酶也可催化内源性和外源性的环氧化物,其中对内源性环氧化物的速率远大于外源性的环氧化物。因为环氧化物水解酶在致癌物的形成中扮演一定角色,所以被作为肝癌的早期标志而受到广泛关注。可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,s EH)在调控机体环氧化物代谢中发挥重要作用,其主要功能是降解环氧花生四烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs),并使其生物活性降低。通常情况下,EETs是由花生四烯酸(arachidonic acid,AA)经过肝脏中大量存在的细胞色素P450代谢而形成的代谢产物。EETs的生物学功能较为复杂,在肿瘤中可以调控肿瘤细胞的迁徙和转移,在心血管疾病中,EETs则可以抑制炎症过程及血小板聚集,降低动脉粥样硬化脂质斑块形成及破裂,促进粥样硬化梗死区血管生成等多种生物活性,因此,近年研究也将s EH及s EH抑制剂作为粥样硬化、冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)及高脂血症等疾病的主要治疗靶点。在本研究中,我们进一步探讨s EH在动脉粥样硬化发生发展中的重要作用,以期为s EH作为动脉粥样硬化的治疗靶点提供丰富的理论依据。目的在我国动脉粥样硬化患者中进行可溶性环氧化物水解酶检测,探讨动脉粥样硬化患者血脂水平,冠心病患者超声心动指标与外周血可溶性环氧化物水解酶水平相关性。方法(1)根据动脉粥样硬化临床诊断标准,在就诊于我院门诊及住院的患者中筛选AS患者,冠状动脉粥样硬化性心脏病患者,并随机筛选同期就诊于我院健康体检中心年龄、性别比例匹配的健康对照者;(2)查阅文献并进行调查问卷设计,收集患者各项生化检查及超声心动检查指标,签署知情同意书;(3)采集外周静脉血,4℃离心取上层血清样品检测入组患者及健康对照者中外周血s EH水平,并进行统计学分析;(4)使用Spearman相关分析进一步分析患者s EH水平与血清学指标以及超声心动指标之间的相关性。结果(1)自2014年1月至2015年6月,参考AHA关于动脉粥样硬化诊断标准,筛选就诊于我院动脉硬化门诊的粥样硬化病人214例,冠心病病人138例,并筛选同期就诊于我院健康体检中心,且年龄性别比例匹配的健康成人182例;(2)各组患者年龄、性别匹配,对此进行均衡性检验,结果显示年龄组(P=0.2310.05),性别组(P=0.8440.05)两组比较均无统计学意义,年龄、性别均衡,组间具有可比性;(3)我们对入组患者及健康对照进行组间相关性的显著性检验,判断与疾病密切相关的病因因素。由于变量较多,首先采用单因素分析,发现在我们关注的16项可疑因素中,有6项是与研究疾病有关联的。由于血糖值无法用两项分类,因此我们对上述指标采用定量分析方法。受教育程度和职业属于等级分类指标,采用了秩和检验。由表1-5可知:吸烟(P0.001)、总胆固醇(P=0.0040.05)、甘油三酯(P=0.0210.05)、低密度脂蛋白(P0.001)、高血压病(P0.001)具有统计学意义;(4)我们使用酶联免疫吸附试验检测三组患者外周血s EH表达水平,结果发现,与健康对照组(0.21±0.02)ng/ml相比,AS组(128.48±19.42)ng/ml及CHD组(131.21±18.52)ng/ml患者外周血s EH水平明显增高,差异具有统计学意义(F=28.32,P=0.001),而AS组及CHD组患者比较,未见明显统计学差异(F=1.87,T=0.33);(5)对三组患者超声心动指标进行检测及统计学分析发现,CHD组患者EF为(45.4±4.6)%,明显低于单纯AS者(58.3±8.5)%及健康对照(60.9±4.2)%,而CHD患者(58.7±3.5)mm及AS组(58.2±2.8)mm左心室舒张末期径(LVEDD)明显高于及健康对照者(52.3±5.3)mm,差异具有统计学意义(P0.05);(6)进一步使用方差齐性检验对血糖等数据进行统计学分析。将数值输入SPSS 20.0统计学软件中得出结果(见表1-8),结果发现,日静坐时间、空腹血糖均无统计学意义,只有日体力活动时间(P=0.0010.05)是AS相关因素。受教育程度非两项分类,而是用等级分类,对此采用秩和检验,见表1-9结果显示:Z=1.8391.96,P=0.0680.05差别无显著性,无统计学意义,说明受教育程度并不是AS相关因素;(7)进一步对职业性质进行秩和检验,结果表明,P0.001,说明两组间差别具有显著性,职业是AS相关因素之一;(8)经显著性检验后,确认6项为AS的相关危险因素。为进一步探讨相关因素与AS相关性,矫正混杂因素。将多种变量纳入多因素分析,最终导入非条件Logistic回归模型。采用后退法再逐个进行筛选,选入变量的概率标准为0.05,剔除标准为0.05。结果表明,吸烟、高血压、职业、低密度脂蛋白、总胆固醇具有统计学意义(P0.05);(9)以s EH为自变量,其余相关风险因素为因变量,使用Spearman相关分析对上述数据之间的相关性进行统计学分析,结果表明,s EH与高密度脂蛋白呈负相关,rs=-1.18,y=-1.18x-12.381,而与低密度脂蛋白水平呈正相关,相关系数rs=0.24,y=0.24x+1.398,差异具有统计学意义(P0.05);(10)对入组患者外周血s EH与超声心动相关指标进行Spearman相关性发现,在CHD患者中,外周血s EH水平与射血分数EF呈负相关,相关系数rs=-0.12,y(EF)=-0.12x+9.343而与左心室舒张末径LVEDD呈正相关,相关系数rs=0.16,y(LVEDD)=0.16x-2.587,差异具有统计学意义(P0.05)。我们认为,监测外周血s EH水平对于评估患者心脏重塑具有很好的提示作用。结论(1)吸烟、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高血压病及日体力活动时间都是AS发生的高危因素,在临床治疗及预防AS过程中应当在药物治疗的同时,改善患者危险因素暴露程度。(2)s EH在AS及CHD患者中表达水平增高,与血清低密度脂蛋白胆固醇水平呈正相关而与血清高密度脂蛋白胆固醇水平呈负相关,此外,在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者中,其表达水平与射血分数EF值呈负相关,而与左心室舒张末径呈正相关,可以在临床提示动脉粥样硬化心脏病心脏重塑的发生。第二部分可溶性环氧化物水解酶对细胞胆固醇代谢的研究背景在人体中,编码可溶性环氧化物水解酶的基因为EPHX2,其位于人类第8号染色体,可以编码555个氨基酸。在生物化学结构上,该基因编码蛋白质具有N端磷酸酶结构域及C端可溶性环氧化物水解酶结构域两个主要的化学结构,这两个结构以二聚体形式相结合并稳定存在。其中,N末端通常具有磷酸酶活性,正常情况下,可通过去磷酸化异戊烯焦磷酸途径,调节血清胆固醇水平及细胞信号传递过程;其C末端是可溶性环氧化物水解酶结构域,这一部分可催化体内脂质信号分子花生四烯酸环氧化合物类,通过结合一个水分子,形成二醇结构进行降解及破坏,从而使调控血清内ETTs水平。在某些特殊情况下,如炎症,外界环境变化或遗传因素作用下,使得EPHX2表达水平异常增加,大量转录形成可溶性环氧化物水解酶后,体内相对平衡的ETTs水平则受到破坏,而ETTs在人体多种组织器官中都可以发挥调控作用,如调节血管收缩舒张,调节肾脏血流量,调节肾小管滤过和重吸收作用等。血管稳态由内皮细胞和血管平滑肌细胞增殖和迁移共同影响和调控,而s EH似乎在这些生物学过程中起着重要的作用。EETs可以促进内皮细胞增殖、迁移和血管生成,其环氧化物具有促进小鼠和人类细胞的增殖的作用,EETs或CYP2C氧化酶的过度表达可以引发细胞增殖,这一过程可能与两种细胞信号通路的激活有关;p38丝裂原蛋白激酶(MAPK)通路和PI3K-AKT信号(PI3K/Akt)通路。11,12-EET激活MAPK,并上调cyclin D和Akt,磷酸化FOXO因子,并降低内皮中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27kip1蛋白的活性。最近研究报道,11,12-EET介导的细胞增殖,迁移和成管作用在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)实验中被证明可以激活鞘氨醇激酶1(SK1)促进磷酸鞘氨醇合成S1P。另一方面,可以作用于血管平滑肌细胞,发挥抗迁移作用。11,12-EET与14,15-EET可以轻度抑制主动脉平滑肌细胞迁移,作为对血小板衍生生长因子和CYP2J表氧化酶过表达或s EH抑制的反应,可以减少平滑肌细胞增殖和迁移。激活c AMP依赖的PKA信号通路及cyclin D水平,降低EETs活化及s EHIs的血管内皮细胞迁移能力。尽管上述研究结果表明,s EHIs对血管平滑肌细胞的迁移具有一定影响,但也有研究报道,s EHIs影响或导致血管平滑肌细胞增殖的作用尚不明确。更重要的是,在体内实验皮下海绵模型中,EETs可以刺激并引发血管新生,而抑制s EH则可以通过增强促血管新生和新生血管化反应促进血管新生。EETs和s EHIs在内皮及血管平滑肌细胞增殖及迁移中的作用表明,这一通路在血管新生,动脉粥样硬化等心血管疾病中发挥重要作用,并有望作为潜在的药物治疗靶点。由此可见,EETs在心血管领域具有重要的作用,因此,在心血管病人中,有针对性地保护体内EETs水平,降低外周血可溶性环氧化物水解酶水平可能发挥一定的抗动脉粥样硬化作用。在上一部分研究中,我们已经发现,在动脉粥样硬化及冠心病患者中,外周血可溶性环氧化物水解酶水平可明显增高,且与患者外周低密度脂蛋白胆固醇呈现正相关,而与高密度脂蛋白呈现负相关现象。但是,编码可溶性环氧化物水解酶的基因EPHX2在脂质代谢以及维持细胞内LDL与HDL平衡等生物学作用尚不明确。由于EPHX2在脂质代谢中的特殊作用,如使用si RNA将细胞内EPHX2基因完全敲除有碍于细胞的正常生长,在在体研究中,EPHX2基因敲除后,由于胆固醇及脂质代谢出现异常,基因敲除鼠的存活时间通常较短。这也成为目前体外研究中的瓶颈。但也提示我们,是否可以通过基因编辑的方法,设计某位点突变的EPHX2载体,既可以保证细胞及实验动物的正常生长,又可以对探讨和深入研究EPHX2基因功能可能发挥一定优势。目的构建野生型及突变型质粒,进一步探讨编码可溶性环氧化物水解酶基因EPHX2对细胞胆固醇代谢的作用。方法(1)据野生型质粒WT,构建突变型质粒并一代测序验证,体外转染至293T细胞系;(2)收集转染后的WT细胞及转染突变质粒的细胞,使用免疫印迹法检测EPHX2蛋白表达水平,进一步检测PKA信号通路活化情况;(3)使用可溶性环氧化物水解酶活性试剂盒检测细胞中EPHX2的酶活性水平;连续培养48h后,使用MTT实验检测293T细胞的细胞活力;(4)采用流式分析仪检测EPHX2对LDLR内吞LDL功能的影响;并检测293T细胞细胞周期并进行统计学分析;(5)采用流式分析仪检测EPHX2对LDLR结合LDL功能的影响;(6)使用Transwell实验检测293T细胞的侵袭能力;使用划痕实验检测细胞的迁移能力;(7)Western Blotting实验检测各组细胞PKA表达水平并进行统计学分析。结果(1)以野生型EPHX2载体质粒为模板,对进行扩增,产物转化至大肠杆菌感受态细胞,经摇菌扩增提取质粒,最终测序证实:所挑克隆为目的基因克隆。(2)可溶性环氧化物水解酶分子量约为62KDa,而GFP标签蛋白分子量约28KDa,因此EPHX2-GFP融合蛋白分子量约90KDa左右,在调整GAPDH一致情况下,正常组即不做任何处理的细胞因无GFP标签,因此当用GFP标签抗体检测时没有观察到EPHX2-GFP融合蛋白的存在,而野生型及突变型质粒因便于观察带有GFP标签,故在90KDa左右处观察到融合蛋白的存在。(3)以正常细胞EPHX2的酶活性作为细胞中的本底酶活性。通过瞬时转染野生型及突变型EPHX2质粒,过表达EPHX2蛋白,可以检测到转染野生型质粒及突变型EPHX2,细胞的总体酶活性明显较未转染组高,转染突变型EPHX2组可溶性环氧化物水解酶活性较野生型组显著降低(P0.01)。(4)将正常细胞、转染野生型及突变型质粒的细胞铺在六孔板内,1.5μg/ml Dil-LDL抗体于37℃孵育4小时,流式细胞仪检测各组细胞LDLR内吞LDL的能力。结果表明EPHX2显著影响LDLR内吞LDL功能,其LDLR内吞LDL能力相对野生型下降25.3%,具有统计学差异(P0.05)。(5)将细胞种在六孔板内,Dil-LDL抗体4℃孵育4小时,流式检测EPHX2对LDLR结合LDL能力的影响。结果表明EPHX2可显著影响LDLR结合LDL的功能,LDLR结合LDL能力相对野生型下降19.5%,具有统计学差异(P0.05)。(6)将293T细胞中转入野生质粒及突变质粒后,在37℃,5%CO2条件的孵育箱中连续培养48h后,我们发现,与WT组相比,突变组中293T细胞的增殖速率明显高于干预对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。Transwell小室法检测细胞侵袭能力发现,R287Q组细胞侵袭能力明显高于WT组及CON组,差异具有统计学意义(P0.05),提示突变后293T细胞侵袭能力增强。(7)在转入EPHX2野生型及突变型质粒后,检测细胞周期发现,与WT组相比,R287Q组细胞S期细胞数量明显小于WT组,差异具有统计学意义(P0.05)。(8)使用Transwell法检测R287Q及WT,CON细胞迁徙能力发现,与0h相比,三组细胞划痕距离均明显缩小,但R287Q组缩小程度明显小于CON及WT组,说明48h R287Q组细胞迁徙能力明显增强,差异具有统计学意义(P0.05)。(9)进一步检测三组细胞PKA信号通路表达水平发现,与WT组及CON组相比,R287Q组细胞PKA表达水平明显减低,提示EPHX2基因可能通过PKA信号通路发挥调节作用。结论EPHX2突变后可降低可溶性环氧化物水解酶的活性,降低细胞LDLR对LDL的内吞和结合功能,通过PKA通路发挥这一生物学作用。
【图文】：

正态分布,定点诱变,突变体,位点

（2）1.5%的琼脂糖凝胶配置方法：基本配置方法和步骤同上，但是需要将琼脂糖的质量改为 1.5g。15 统计学分析对于符合正态分布的实验数据采用均数±标准差表示，通常采用独立样本 t检验来表示两组间均数的比较，而非正态分布数据则采用非参数检验，应用Graphpad prism 6.0 统计软件，，以 P＜0.05 为有差异，P＜0.01 有显著差异，有统计学意义。实验结果1 EPHX2 与 GFP 融合表达载体的构建以野生型 EPHX2 载体质粒为模板，对其进行扩增，产物转化至大肠杆菌感受态细胞，经摇菌扩增提取质粒，最终测序证实：所挑克隆为目的基因克隆见图 2-1。

野生型,质粒,酶活性,转染

图 2-2 野生型及质粒中 EPHX2 蛋白的表达型 EPHX2 活性检测EPHX2 的酶活性作为细胞中的本底酶活性。通X2 质粒，过表达 EPHX2 蛋白，可以检测到体酶活性明显较未转染组高，转染突变型 EPHX野生型组显著降低（**P<0.01）见图 2-3。图 2-3 EPHX2 活性检测结果（mean+MEM，n=3）
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5

【参考文献】