RGS5对小鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响及其机制研究

发布时间：2019-08-29 13:23

【摘要】：背景：缺血再灌注(IR)损伤在冠状动脉疾病和心脏移植的发展中起着重要作用,可以引起心肌细胞凋亡,而凋亡性细胞死亡在IR损伤中扮演了关键的角色。分子量为38kD的促分裂素原活化蛋白激酶(p38)和核内原癌基因c-Jun氨基末端激酶1/2(JNK1/2)的信号通路可以促进心脏缺血再灌注所诱发的心肌细胞凋亡,这些信号通路是通过刺激G蛋白偶联受体(GPCRs)而被激活的。G蛋白信号调节因子5(RGS5)是一种G蛋白介导信号的负性调节因子,在鼠科动物和人类成年心脏不同细胞里高度表达,在胚胎发育、伤口愈合和生殖周期维护过程中发挥作用,并参与血管生成、血管外膜细胞成熟和心肌复极化,这与高血压、动脉粥样硬化、心律失常和心力衰竭的发病机理有关。然而RGS5在心脏缺血再灌注所诱发的心肌细胞凋亡中所起的作用还不清楚。第一部分RGS5对在体小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的影响目的：探索RGS5对在体小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的影响方法：通过制备在体心脏I/R(30分钟/24小时)模型,应用血流动力学、TUNEL、免疫组化染色、RT-PCR和免疫印迹检测,研究心脏特异性RGS5转基因小鼠(TG)、RGS5基因敲除型小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的心肌细胞凋亡和心功能变化。结果：研究表明,与WT组或KO组小鼠相比,在心脏IR期间TG组小鼠可显著地抑制心肌细胞凋亡,证据是TUNEL染色水平较低、Bax表达水平降低,而Bcl-2表达水平升高；此外,与WT组或KO组小鼠相比,在心脏IR期间TG组小鼠的心脏功能异常显著减轻,证据是血流动力学参数如+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax、LVESP和△LVP更显著增加,而LVEDP明显减少。结论：本研究证实RGS5可以抑制在体心脏IR期间的心肌细胞凋亡。第二部分RGS5对离体小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的影响目的：探索RGS5对离体小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的影响方法：一种Langendorff灌注I/R(15分钟/30分钟)模型应用于心脏特异性RGS5转基因小鼠(TG)、RGS5基因敲除型小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)的离体心脏,应用血流动力学、透射电镜、TUNEL、免疫组化染色、RT-PCR和免疫印迹检测,研究心肌细胞凋亡和心功能变化。结果：研究结果表明,与WT组或KO组小鼠相比,TG组小鼠显示心脏功能异常的改善,比如+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax、LVESP和△LVP等血流动力学指标水平上升,而LVEDP明显下降。我们还发现在缺血再灌注期间,通过透射电子显微镜(TEM)、TUNEL、免疫组织化学(IHC)和RT-PCR分析,与WT组或KO组小鼠相比,TG组小鼠心肌细胞凋亡受得抑制,表现为核萎缩或染色质凝聚明显减少,TUNEL和促凋亡标记物如Bax的阳性表达明显减少,而抗凋亡标记物如Bcl-2的表达明显增加。结论：这些研究表明,在心肌缺血再灌注期间,RGS5可以抑制离体心脏IR期间的心肌细胞凋亡。第三部分抑制p38和JNK1/2信号通路对RGS5基因敲除小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的影响目的：探索抑制p38和JNK1/2信号通路对RGS5基因敲除小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的影响。方法：一种Langendorff灌注IR(15分钟/30分钟)模型应用于野生型小鼠(WT)、人类RGS5表达心脏特异性转基因小鼠(TG)和RGS5敲除型小鼠(KO)的心脏,观察p38和JNKl/2蛋白的表达情况,以及通过抑制p38和JNK1/2信号通路应用血流动力学、透射电镜、TUNEL、免疫组化染色、RT-PCR和免疫印迹检测,观察RGS5基因敲除小鼠心脏缺血再灌注期间心肌细胞凋亡和心功能的变化。结果：我们发现,在IR组与WT或KO心肌相比,TG心肌的p38和JNK1/2磷酸化程度减少。而在IR组与WT心肌相比,KO心肌显示JNK1/2和p38磷酸化的增加。在IR期间RGS5-KO、鼠心肌与给予生理盐水(NS)处理组相比,在给予SB203580(一种p38抑制剂)+SP600125(一种JNK1/2抑制剂)处理组的电镜观察核萎缩或染色质凝聚程度明显减低,TUNEL染色阳性细胞和促凋亡标记物如Bax的表达明显减少,但抗凋亡标记物如Bcl-2表达的程度明显增强。此外,在心脏IR期间,RGS5-KO小鼠心脏与NS处理组相比,SB203580+SP600125处理组的血流动力学指标如+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax、LVESP和ALVP显著提高,而LVEDP明显减少。结论：这些研究表明,在心肌缺血再灌注期间,RGS5可以通过抑制p38和JNK1/2信号通路来减少心肌细胞凋亡。这些发现通过靶向RGS5相关信号转导途径可能为治疗心肌缺血再灌注诱发的心肌细胞凋亡提供了改进方案。
【图文】：

异调１邋Ａ－Ｅ）。此外，与化后ＷＴ小鼠相比，，ＴＧ小鼠的屯、脏功能异常显著减轻，逡逑证据是血流动力学参数如＋ＬＶｄｐ／血ｍａｘ、－ＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘ、ＬＶＥＳＰ和么ＬＶＰ更显著增逡逑加，而ＬＶＥＤＰ明思减少（图２）。为了进一步研究ＲＧＳ５过表达对化后也肌细胞逡逑调ｔ的影响，我们比较屯、肌化处理对ＴＧ和Ｋ０小鼠的影响。我们发现与ＫＯ逡逑小鼠屯、脏相比，ＴＧ小鼠屯、肌显示化诱发屯、肌细胞调亡的抑制，证据是显示逡逑ＴＵＮＥＬ、Ｃａｓｐａｓｅ邋３和Ｂａｘ阳性屯、肌细胞明显减少，Ｂｄ－２阳性细胞增加。在对逡逑照组没有发现显著差异（图１邋Ａ－巧。此外，与ＩＲ后ＫＯ小鼠也脏相比，ＴＧ小鼠逡逑也脏的血流动力学参数如＋ＬＶｄｐ／血ｍａｘ、－ＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘ、ＬＶＥＳＰ和ＡＬＶＰ明显增加，逡逑但相比之下ＬＶＥＤＰ明显减少（图２）。然而，在对照组ＴＧ和ＫＯ小鼠之间没有发逡逑现明显差异。逡逑为了进一步确定ＲＧＳ５－ＫＯ对也肌细胞调亡的影响，我们比较屯、脏ＩＲ期间逡逑的ＫＯ小鼠与ＷＴ小鼠。我们发现与ＷＴ小鼠相比

ＲＧＳ５对化期间也肌细胞调亡的影响逡逑屯、脏组织ＲＧＳ５免疫印迹实验表明Ｋ０小鼠的ＲＧＳ５基因被成功敲除，ＴＧ逡逑小鼠的ＲＧＳ５基因被过度表达（图３）。逡逑为了确定在屯、脏化期间过表达ＲＧＳ５是否抑制细胞调ｔ，ＴＧ小鼠和同窝出逡逑生ＷＴ小鼠用于屯、脏化。我们的结果显示，与ＷＴ小鼠相比在屯、脏化期间，ＴＧ逡逑小鼠可显著地抑制也肌细胞调亡，证据是ＴＵＮＥＬ染色水平较低、Ｃａｓｐａｓｅ邋３和逡逑Ｂａｘ表达水平降低，而Ｂｃｌ－２表达水平升高；然而，在对照组没有发现明显的差逡逑异调１邋Ａ－Ｅ）。此外，与化后ＷＴ小鼠相比，ＴＧ小鼠的屯、脏功能异常显著减轻，逡逑证据是血流动力学参数如＋ＬＶｄｐ／血ｍａｘ、－ＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘ、ＬＶＥＳＰ和么ＬＶＰ更显著增逡逑加，而ＬＶＥＤＰ明思减少（图２）。为了进一步研究ＲＧＳ５过表达对化后也肌细胞逡逑调ｔ的影响，我们比较屯、肌化处理对ＴＧ和Ｋ０小鼠的影响。我们发现与ＫＯ逡逑小鼠屯、脏相比
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541

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本文编号：2530545