Fip200siRNA-DNA纳米材料调控肺动脉平滑肌细胞生长及机制研究

发布时间：2019-09-11 07:47

【摘要】：研究背景:肺动脉高压[1](Pulmonary arterial hypertension,PAH)是以肺血管阻力进行性升高为特征的一组疾病,常伴有右心室的肥厚及扩张,致残率及病死率高,除了传统的药物治疗外,基因治疗、活体肺移植等新的治疗手段逐渐出现,但仍严重威胁人类健康。其中缺氧引起的肺动脉高压,多由慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张等疾病引起。肺血管重构[2](Pulmonary vascular remodeling,PVR)学说认为低氧条件下,肺动脉中存在的肺血管内皮细胞及肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的异常增殖及凋亡。自噬作为细胞内维持稳态的重要途径,在肺血管重构中有重要调节作用[3]。目前,肺动脉平滑肌细胞在肺血管重构中的自噬的改变尚不十分明确。Fip200作为重要的自噬基因,通过研究Fip200在肺血管重构中的作用,有望为PAH的机制研究找到新方向。纳米技术作为新兴技术在医学医用领域有宽阔前景,特别是作为运载载体,能高效转运药物。小RNA作为重要的RNA,能调控基因的表达,是基因治疗的重要方法,但因其运载方式受限,影响其进一步应用。将基因治疗与纳米技术融合,可改善小RNA的转运问题。DNA纳米材料有别于传统的脂质体、病毒、高分子聚合物等传统的纳米材料,可利用DNA杂交原理,实现自组装,简单、可控,且本身具有无毒、无免疫源性的特点[4]。核酸适配体是以核酸为基础,能特意识别细胞的物质。因此,设计转载核酸适配体的自组装DNA纳米材料,为基因治疗建立运载平台。因此,我们设计了一种由三种DNA单链携带Fip200siRNA,通过DNA-RNA杂交技术,组装成的新型三角板材料。通过凝胶电泳,验证其合成效率。通过RT-PCR及Westernblot检测其对目的基因的干扰作用,研究低氧条件下Fip200在肺血管平滑肌异常增殖及凋亡中的作用,以及低氧条件下Fip200对于TGF-β通路的作用。研究目的:1.合成一种新型的携带si RNA的DNA三角板运载体,检测其对在PASMCs中的转运效率。2.研究低氧条件下Fip200对PASMCs的增殖、凋亡及表型转化的影响。3.探讨低氧条件下Fip200影响PASMCs的增殖、凋亡及表型转化的机制。研究方法:1.DNA自组装三角板纳米材料的构建及其转运效率的研究。(1)构建携带Fip200si RNA的DNA三角板纳米材料,通过凝胶电泳检测其产率,通过激光共聚焦及流式细胞术检测其转染效率。(2)使用RT-PCR及Westernblot检测携带Fip200si RNA的DNA三角板纳米材料对PASMCs细胞中Fip200基因表达的干扰效果。2.培养大鼠肺动脉平滑肌细胞,检测低氧条件下PASMCs增殖凋亡的改变及Fip200siRNA对其影响。(1)使用Westernblot检测低氧条件下PASMCs增殖、凋亡及自噬的改变。(2)采用流式细胞术及MTT检测Fip200siRNA对低氧条件下PASMCs增殖、凋亡的影响。(3)使用WB检测Fip200siRNA对PASMCs细胞中TGF-β的影响。研究结果:1.构建了携带Fip200si RNA的DNA三角板纳米材料,并转载了PASMCs的核酸适配体,通过非变性凝胶电泳,验证其自组装的效率。2.通过WB及RT-PCR的方法,验证携带Fip200siRNA的DNA三角板纳米材料对于PASMCs中Fip200的抑制效率,明显降低了目的基因在mRNA及蛋白水平的表达。3.低氧条件下,PASMCs存在增殖的高表达及凋亡的低表达状态,并存在高水平自噬的状态。4.携带Fip200siRNA的DNA三角板纳米材料转染PASMCs后,有效的抑制了低氧条件下的自噬,并且抑制了细胞的增殖,促进了细胞的凋亡。5.低氧条件下,Fip200si RNA下调了TGF-β通路,其可能与对细胞增殖及凋亡影响有关。结论:1.成功研制了携带核酸适配体的DNA三角板纳米材料,能高效转运Fip200si RNA向PASMCs,并实现Fip200的抑制。2.低氧条件下PASMCs的高增殖、低凋亡的异常状态,于高自噬存在关系,抑制Fip200的表达,能逆转这一过程。3.Fip200调控PASMCs的增殖、凋亡,可能与其下调TGF-β通路有关,但仍需进一步验证。
【图文】：

模式图,自组装,模式图,义序

载体结构设计简单，仅由四条核酸链构成，易于合成。另外，为便于对照，合成携带无义序列NC siRNA的阴性对照组纳米载体，其中1A链不变，2A链与NCsiRNA碱基互补配对。（图2-1）

凝胶电泳,转染效率,转染,纳米材料

图 2-2 携带 Fip200siRNA 的纳米载体的凝胶电泳检测不同浓度的 siFip200-DYM 纳米材料在 PASMCs 细胞内的转染效胞术检测携带 Fip200siRNA-Cy3 的 TNP-aptamer 在不同浓度转ip200-DYM 中 siFip200 的浓度依次为 0 nM、25 nM、50 nM、10 作为对照组，转染 12h 之后应用流式细胞仪检测各组转染效率米载体系统的转染浓度的增加，其转染效率逐渐增加（P<0.0YM (siFip200：25nM)组转染效率明显的高于单独的 Fip20组，提示纳米材料可以明显提高 siRNA 的转染效率，并且具有。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R544.1

【参考文献】